2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝患者外周血TLR4、NF-κB mRNA水平及其與胰島素抵抗的關系

王玉楠,徐 丹,許 琳,吳瑤強

遼寧省丹東市第一醫院內分泌科，遼寧丹東 118000

2型糖尿病(T2DM)占所有糖尿病患者的90%以上，其發病機制為胰島素抵抗(IR)和胰島β細胞分泌不足[1]。近年來研究發現，伴IR者肝細胞在長期脂肪蓄積下可逐漸發生變性，罹患非酒精性脂肪肝(NAFLD)風險更高[2]。臨床數據顯示，NAFLD在普通人群中發病率約為2.00%，而在T2DM患者中則為28.00%～55.0%[3]，二者既可能是彼此發生的危險因素，又可能是同一病因的不同病理特征，且T2DM合并NAFLD患者糖脂代謝紊亂和IR現象更加明顯。核轉錄因子-κB(NF-κB)/Toll樣受體4(TLR4)信號通路是參與機體炎癥級聯反應的重要一環，越來越多的研究證明，其與天然免疫、脂肪代謝、IR及血管炎癥和動脈硬化等存在密切關系[4-6]，提示NF-κB、TLR4可能在T2DM、NAFLD發病機制中發揮重要作用。但外周血NF-κB、TLR4的表達變化是否與T2DM合并NAFLD患者IR嚴重程度有關仍缺乏系統研究。基于此背景，本研究通過觀察T2DM合并NAFLD患者NF-κB、TLR4 mRNA的表達變化，以期更加全面深入地探討二者與IR的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2020年8月至2021年8月本院收治的T2DM患者187例作為研究對象，根據是否合并NAFLD分為合并NAFLD組99例，未合并NAFLD組88例。(1)納入標準：①NAFLD診療標準參考2016版歐洲肝病學會NAFLD診療指南[7]，T2DM符合2013年中華醫學會糖尿病學分會制定的相關診斷標準[8]；②臨床癥狀主要表現為腹脹、乏力或肝區隱痛等；③既往男性飲酒量每周小于140 g或女性每周小于70 g；④未合并惡性腫瘤、其他嚴重全身性疾病或感染性疾病。(2)排除標準：①由于智力、精神或語言障礙，不能表達主觀不適癥狀；②存在腎功能不全，血肌酐>正常值上限1.5倍；③近3個月內服用過影響肝功能、鈣磷代謝或糖代謝的藥物；④有急慢性肝炎、肝硬化或肝癌病史；⑤孕婦或哺乳期女性；⑥血色病及抗胰蛋白酶缺乏癥等其他原因所致肝臟疾病。另外選擇健康體檢中心100例健康成年人為對照組，其中男53例，女47例。所有研究對象自愿加入本研究，并簽署知情同意書，本研究已通過本院醫學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1基線資料收集 收集所有研究對象年齡、身高、體質量資料，身高精確度為0.01 m，體質量精確度為0.1 kg，并計算體質量指數(BMI)。

1.2.2標本采集及生化指標檢測 清晨采用抗凝管(北京科美信生物技術有限公司)采集所有研究對象空腹(10 h)外周靜脈血10 mL。取5 mL血液標本采用iChem-530全自動生化分析儀(深圳市庫貝爾生物科技有限公司)檢測患者空腹血糖(FPG)、血脂指標[甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)]、肝功能指標[丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)]、糖化血紅蛋白(HbA1c)及肝臟脂肪含量(LFC)等指標。計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)，HOMA-IR=FPG×空腹胰島素(FINS)/22.5[9]。根據HOMA-IR值將187例T2DM患者分為HOMA-IR<1.2組、HOMA-IR 1.2～1.6組、HOMA-IR>1.6組。

1.2.3外周血單個核細胞(PBMC)中TLR4、NF-κB表達檢測 取外周靜脈血4 mL，分為2份。1份標本中滴入CD14-PE-CY7(美國BD公司)，室溫下遮光孵育18 min，再滴入1 mL紅細胞裂解液(上海恒斐生物科技有限公司)，18～25 ℃下遮光孵育10 min，離心處理去除上清液，滴入500 μL固定/滲透溶液(上海玉博生物科技有限公司)，18～25 ℃下遮光孵育20 min，離心處理去除上清液，選擇1 mL BD磷酸洗滌緩沖液進行細胞破膜，然后滴入TLR4-PE(北京蘭博利德商貿有限公司，貨號：MA120237)，室溫下遮光孵育30 min，再滴入1 mL BD磷酸洗滌緩沖液沖洗細胞，離心處理去除上清液，予200 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)(上海恒斐生物科技有限公司)重懸細胞配備為單細胞懸液。使用流式細胞儀(北京東迅天地醫療儀器有限公司)測定TLR4在PBMC中的表達情況。

另1份標本根據Trizol法提取標本細胞總RNA，所提取的總RNA質量和濃度均符合PCR反應要求，測定A260、A280值，并計算總RNA濃度，-80 ℃凍存，所有標本均于1個月內集中檢測。按照反轉錄試劑盒說明書，選擇2 μL RNA溶液行反轉錄，獲得cDNA模板。以β-actin為內參，RT-PCR法檢測NF-κB mRNA表達，反應完畢后，計算機自動分析并得出標本的NF-κB mRNA，反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s；60 ℃退火20 s；70 ℃延伸10 s，共40個循環。以Primer軟件設計引物，NF-κB上游：TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT；下游：AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG；產物長度：163 bp。β-actin上游：CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG；下游：AACCGCGAGAAGATGACCCAGAT；產物長度：179 bp。為避免因標本總RNA濃度的不同或是其他不可控因素導致的誤差，同一條件檢測3次數值取其平均值，最終結果用公式計算：A=B1(目的基因)/B2(內參基因)。

2 結 果

2.13組各項指標比較 合并NAFLD組、未合并NAFLD組及對照組性別、年齡比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，合并NAFLD組、未合并NAFLD組BMI、ALT、AST、TG、TC、FPG、HbA1c、LFC、HOMA-IR、TLR4及NF-κB mRNA水平均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與未合并NAFLD組比較，合并NAFLD組ALT、AST、TG、TC、FPG、HbA1c、LFC、HOMA-IR、TLR4及NF-κB mRNA水平均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組各項指標比較(n/n或

組別nLDL-C(mmol/L)FPG(mmol/L)HbA1c(%)LFC(mU/mL)HOMA-IRNF-κB mRNATLR4(%)對照組1002.37±0.245.04±0.504.72±0.464.11±0.420.65±0.070.19±0.030.40±0.04未合并NAFLD組882.65±0.345.86±0.615.47±0.5511.73±1.181.19±0.120.69±0.144.08±0.69合并NAFLD組992.94±0.398.24±0.836.93±0.7222.39±2.351.68±0.170.95±0.266.57±1.02F5.458.236.5623.4717.1619.8422.16P0.07<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.2T2DM患者發生NAFLD的Logistic回歸分析 單因素Logistic回歸分析結果顯示，患者BMI、FPG、HbA1c、ALT、AST、TG、TC、HOMA-IR、LFC、TLR4及NF-κB mRNA均與T2DM患者合并NAFLD有關(P<0.05)。對單因素Logistic回歸分析結果中有統計學意義的變量進行多因素Logistic回歸分析，發現BMI、TG、LFC、HOMA-IR、TLR4及NF-κB mRNA水平升高是T2DM患者發生NAFLD的危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 T2DM患者發生NAFLD的Logistic回歸分析

續表2 T2DM患者發生NAFLD的Logistic回歸分析

2.3不同HOMA-IR T2DM患者各項指標比較 根據HOMA-IR，將187例T2DM患者分為HOMA-IR<1.2組62例、HOMA-IR 1.2～1.6組67例、HOMA-IR>1.6組58例，隨著HOMA-IR增加，TLR4、NF-κB mRNA、LFC、BMI、HbA1c、TG、LDL-C水平升高，不同HOMA-IR組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同HOMA-IR T2DM患者各項指標比較(n/n或

組別nHDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)FPG(mmol/L)HbA1c(%)LFC(mU/mL)NF-κB mRNATLR4(%)HOMA-IR<1.2組621.04±0.083.25±0.316.51±0.655.01±0.4910.55±1.030.50±0.053.10±0.44HOMA-IR 1.2～1.6組671.09±0.093.64±0.376.69±0.676.11±0.6318.46±1.910.76±0.095.75±0.73HOMA-IR>1.6組581.12±0.114.01±0.406.82±0.687.84±0.7928.76±2.851.06±0.177.39±1.32F1.134.642.318.7410.1813.6516.9P0.210.030.08<0.001<0.001<0.001<0.001

2.4外周血TLR4、NF-κB表達與各項臨床指標的相關分析 Pearson相關分析顯示，外周血TLR4、NF-κB mRNA與BMI、TG、LFC、HOMA-IR在校正前和校正相關因素后均呈正相關(P<0.05)。見表4。

表4 外周血TLR4、NF-κB表達與各項臨床指標的相關分析

3 討 論

T2DM是一種慢性終身疾病，其病理機制較為復雜，在糖耐量異常階段，肝臟脂肪變性的發生率為33.3%～69.6%，當肝糖原儲存量超過肝臟儲存閾值時，即可形成代謝應激性肝損傷，提示在T2DM發病前，肝臟的脂質代謝已經發生了紊亂[10]。有研究發現，脂質過氧化和氧化應激反應引發的肝臟炎癥水平升高和纖維化是導致NAFLD發生的直接因素[11]，然而近年來發現其“第一次打擊”即IR引發的肝細胞脂肪變性也扮演了尤為重要的角色。IR是T2DM病理表現，IR可導致胰島素抑制脂肪酶的活性下降，進而上調游離脂肪酸(FFA)表達，FFA的利用不足和大量氧化可直接導致TG水平升高，進而使脂肪大量堆積于肝細胞中，而影響NAFLD的發生、發展[12]。然而現階段研究尚未完全闡明IR的發生機制，故進一步明確T2DM合并NAFLD的IR發生機制，對臨床醫師早期評估其IR狀況，采取相關控制措施，以阻斷病情進一步發展，改善此類患者預后意義重大[13]。

本研究觀察了T2DM患者外周血NF-κB、TLR4表達變化，發現在對照組、未合并NAFLD組、合并NAFLD組中TLR4及NF-κB mRNA水平依次升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，這提示外周血NF-κB、TLR4可作為T2DM發生NAFLD的預警指標。目前研究認為，T2DM、NAFLD、IR均存在慢性低度炎性反應，TLR4參與諸多慢性炎癥疾病的病理過程和免疫應答，也是與IR關系最為密切的Toll樣受體(TLRs)之一[14-15]，其可以直接激活炎癥性激酶和活性氧簇而直接抑制胰島素生物學效應，也能夠活化NF-κB并促進炎癥介質的激活及釋放去敏感化因子，而間接導致IR[16]。NF-κB是一種具有多項調節作用的轉錄因子，當代謝性炎性反應和IR等活化因素刺激其結合位點，NF-κB被激活后，可促使NF-κB與1κBα解離，并迅速轉移至核內而激活，導致炎癥介質增多，加重組織和循環炎性反應[17]，同時T2DM患者機體內本身存在白細胞介素(IL)-6、IL-8與腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎癥介質的過度分泌，由此造成的炎癥級聯放大反應可造成遠處臟器的病理損傷，又可正反饋進一步促進NF-κB的活化，導致IR加劇[18]。同樣，本研究也通過Logistic回歸分析發現，TLR4及NF-κB mRNA水平升高是T2DM患者發生NAFLD的危險因素。

另外，本研究根據HOMA-IR將187例T2DM患者進行分組，結果顯示TLR4及NF-κB mRNA水平隨著HOMA-IR增加而升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。同時通過Pearson相關分析發現，校正相關因素后，患者外周血TLR4、NF-κB mRNA與HOMA-IR仍具有相關性(P<0.05)，提示外周血TLR4、NF-κB和IR在T2DM合并NAFLD的發生過程中可能起到交互作用。考慮可能機制如下：TLR4/NF-κB信號通路激活后產生系統性代謝性炎性反應的情況下，肝臟自噬受抑制，肝臟脂肪變性和內臟脂肪沉積，同時可能促發內質網應激反應等，如c-Jun氨基末端激酶信號通路[19]和p38 MAPK信號通路[20]等其他炎癥信號通路被激活并引起信號轉導級聯反應，從而減弱肝臟和系統對胰島素的敏感性。

綜上所述，T2DM合并NAFLD患者IR嚴重程度與外周血TLR4/NF-κB信號通路有關，后者可能在T2DM合并NAFLD的發生、發展中起一定作用。但本研究尚存在一些不足之處，首先，納入研究樣本較少，且僅對患者入院時的實驗室指標進行了檢測分析，再加之實驗操作測量誤差等也可能會影響研究結果的準確性；其次，現階段臨床缺乏更新且規范化的診療指南，對患者分層研究仍有主觀性差異，可能對結果造成偏倚。在今后的研究中有必要開展多中心研究，擴大樣本量，以進一步探討外周血NF-κB、TLR4表達水平對T2DM合并NAFLD患者IR嚴重程度的評估價值。