4種不同方法在獻血者梅毒檢測中的應用*

陳邦銳，許婷婷，張 紅，樂 淼

武漢血液中心，湖北武漢 430030

梅毒是由蒼白密螺旋體感染引起的一種常見性傳播疾病，可導致心血管、神經系統、皮膚等全身性病變，近年來其發病率呈上升趨勢。國內采供血機構的血液因梅毒陽性的報廢率也在上升[1]，在血液報廢的傳染類指標中，梅毒陽性報廢率已經超過丙型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒(HIV)陽性的報廢率。有研究報道中國的部分地區無償獻血者梅毒陽性率為0.56%～0.59%[2]，梅毒感染已成為威脅血液安全的重要因素之一，而實驗室對梅毒的準確檢測是治療和控制梅毒傳播的一個前提。目前，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)因檢測成本低，靈敏度高，操作方法簡單成熟，且可以實現自動化、批量化檢測等優點，在采供血機構各實驗室已成為梅毒血清學檢測的主要方法之一。在采供血機構實驗室中，同一項目的ELISA檢測采用兩個不同廠家的試劑同時進行檢測，結果中就有雙試劑陽性和一定比例的單試劑陽性，根據《血站質量管理規范》要求，凡出現梅毒陽性結果均予以屏蔽獻血資格。因此，筆者認為有必要對采用ELISA進行梅毒初篩陽性的獻血者進行梅毒螺旋體明膠凝集試驗(TPPA)、金標試紙條、快速血漿反應素試驗(RPR)檢測，并對不同方法的檢測結果進行比較，目的是為了有效減少血液資源浪費，同時也為獻血者咨詢提供更好的服務，減少獻血者的心理負擔和不必要的糾紛，也為以后的獻血者歸隊提供一定數據支持。

1 材料與方法

1.1標本來源 2018年1—6月本中心采集的78 997份獻血者標本中經ELISA檢出的331份梅毒陽性標本，包括雙試劑陽性標本227份、單試劑陽性(包括灰區值，S/CO≥0.70)標本104份。

1.2儀器與試劑 全自動酶免分析儀FAME，型號24/20(瑞士 HAMILTON)；加樣儀STAR，型號8CH(瑞士 HAMILTON)；洗板機HYDROFLEX(奧地利 TECAN)；酶標儀SUNRISE(奧地利 TECAN)；離心機ST40R(德國 Thermo Fisher)；梅毒自動混旋儀TL-2000B(中國 天力)。廈門新創梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒(試劑A，批號2018047512、2018067518)；廣州麗珠梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒(試劑B，批號2018010208、2018041008)；上海科華梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒(試劑C,批號201708251)，在采樣檢測期間，先以新創和科華試劑組合使用，后期更換為新創和麗珠試劑組合使用。日本富士瑞必歐株式會社TPPA試劑，批號VN81025；上海科華RPR試劑，批號20181005；廈門新創梅毒金標試紙條，批號2018113351。所有試劑均批檢合格，并在有效期內使用。

1.3方法 收集雙試劑陽性標本、單試劑陽性重復檢測仍為陽性標本，同時進行TPPA、金標試紙條、RPR檢測。TPPA檢測時嚴格按照試劑盒說明書進行操作。TPPA步驟如下：室溫條件下在U型板上用稀釋液依次倍比稀釋標本，然后分別加入未致敏和致敏明膠顆粒，振蕩混合30 s，加蓋后于室溫(15～30 ℃)下水平靜置。2 h后，在觀察鏡上記錄并觀察其反應圖像，進行測定結果的判定。 RPR步驟如下：在卡片上滴加一滴試劑，抹勻，然后加50 μL標本，卡片旋轉8 min后觀察結果。

1.4統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件進行數據處理及統計分析，計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

104份ELISA單試劑陽性標本進行TPPA、金標試紙條、RPR檢測，僅3份標本TPPA呈陽性，金標試紙條檢出1份陽性，RPR檢出1份陽性，其余為陰性，見表1。227份ELISA雙試劑陽性標本進行TPPA、金標試紙條、RPR檢測，有209份TPPA呈陽性，梅毒ELISA檢測結果和TPPA確證結果比較，差異有統計學意義(χ2=246.37，P<0.01)。ELISA雙試劑陽性的標本進行TPPA、金標試紙條、RPR檢測，3種方法均陽性39份；TPPA、金標試紙條均陽性，RPR陰性153份；TPPA陽性，金標試紙條、RPR陰性17份；3種方法均陰性18份。ELISA雙試劑檢測的S/CO值與TPPA比較見表2，當S/CO值≥5.00時，ELISA與TPPA符合率很高，當S/CO值<5.00時，二者才略有差異；ELISA單試劑檢測的S/CO值與TPPA比較見表3。

表1 ELISA單試劑陽性標本3種方法聯合檢測呈陽性的3份標本結果

表2 ELISA雙試劑陽性S/CO值與TPPA對應情況(n/n)

表3 ELISA單試劑陽性S/CO值與TPPA對應表(n)

3 討 論

TPPA是目前公認的梅毒確證方法，具有很高的檢測效能，常用于梅毒初篩試驗后的確證檢測，檢測的是梅毒特異性抗體，該抗體可終身存在體內，即使患者被治愈后仍然可以存在；RPR是檢測梅毒患者血液中非特異性的心磷脂抗體，多用于梅毒病情發展判斷和療效觀察，但在感染早期檢出效能低，且治愈后該抗體會逐漸消失；梅毒金標試紙條檢測快速簡單，且對環境要求不高，適合采血現場使用，但靈敏度不高，僅用于獻血前的初篩；梅毒ELISA具有試劑穩定性好、價格適宜、靈敏度較高、操作簡單、可實現批量自動化檢測等優點，因此在采供血機構被廣泛使用。目前行業內多采用兩個不同生產廠家的ELISA試劑同時檢測梅毒特異性抗體。ELISA試劑的方法學多為雙抗原夾心法，該方法靈敏度較高，因而在實際檢測中不可避免地會有假陽性存在[2-3]，同時由于方法學上的缺陷及包被原料的差異，也存在一定的漏檢風險[4]。比較梅毒ELISA試劑呈反應性的331份標本的TPPA、金標試紙條、RPR檢測結果，單試劑陽性的104份標本中僅有3份TPPA確證為陽性，有101份確證為陰性；雙試劑陽性的227份標本中有209份TPPA確證為陽性，18份確證為陰性，ELISA與TPPA檢測結果比較，差異有統計學意義(P<0.05)。以TPPA作為金標準，則ELISA存在較多假陽性結果，統計梅毒ELISA試劑檢出的不合格標本，TPPA總的確證陽性率僅為64.05%(212/331)，但這一結果仍高于胡曉玉等[5]報道的確證陽性率57.24%，以及李玲等[6]報道的確證陽性率38.87%。但是本著安全第一，保護用血者安全的角度考慮，這部分篩查結果為假陽性的血液亦做報廢處理，獻血者資格采取永久屏蔽的策略。這不僅造成血液資源的浪費，還會造成獻血者資源的流失，而且梅毒假陽性結果給獻血者帶來了一些困擾，甚至導致家庭矛盾，產生一定的精神壓力[7]。

本研究結果顯示，梅毒ELISA雙試劑陽性檢測結果的TPPA確證陽性符合率高達92.07%(209/227)，低于王艷彬等[8]在文獻中報道的93.82%；而單試劑陽性檢測結果的(包括灰區標本)TPPA確證陽性符合率為2.88%(3/104)，低于王艷彬等[8]在文獻中報道的7.44%，這得益于本機構工作人員良好的操作能力，以及優良的試劑選擇。血站系統為了提高血液安全性，均采用靈敏度高的ELISA篩查試劑，在實際工作中允許存在一定假陽性結果。另外，根據WHO發布的《篩查獻血者血液經輸血傳播感染的建議書》可知，要求血站開展篩查的同時，也建議開展確證試驗，分別用于獻血者篩查和獻血后服務管理。選擇靈敏度、特異度高的ELISA試劑，并且對ELISA檢測不合格的標本進行梅毒確證試驗，不但可以提高梅毒檢出率、保證血液安全，而且可以減少因為假陽性結果給獻血者帶來的不必要麻煩，減少獻血者的流失；采供血機構咨詢人員也可以更好地開展咨詢工作，為獻血者做好解釋、回訪服務。根據本研究數據，筆者發現ELISA雙試劑陽性的結果S/CO值與TPPA具有很高的符合率，TPPA檢出率與S/CO值呈正比，而ELISA單試劑陽性的標本TPPA確證陽性率極低，且S/CO值與TPPA不具有相關性，因此，筆者建議目前僅針對ELISA單試劑陽性標本進行TPPA確證，這樣可以有效減少工作量，提高效率[9]，即對于梅毒ELISA單試劑陽性且TPPA確證陽性結果的獻血者必須進行屏蔽處理；對于梅毒ELISA單試劑陽性而TPPA確證陰性獻血者可納入獻血者歸隊人群管理，待獻血者滿獻血間隔期后重新進行采樣檢測，再次進行梅毒ELISA及TPPA確證，結果若均為陰性，則獻血者可歸隊，結果仍為陽性者作屏蔽處理。這樣既可以最大限度地保證血液質量，也可以減少因試劑的假陽性結果給獻血者造成的心理負擔，緩解采供血機構與獻血者之間的不必要矛盾，促進采供血事業的可持續健康發展。

本研究結果還顯示，單試劑檢測可能存在漏檢，在確證為陽性的標本中，有3份標本ELISA單側陽性標本其對側檢測結果小于cut off值(0.7)，其 S/CO值別為0.50、0.04、0.40，說明ELISA實行雙試劑檢測還是有必要的，同時筆者準備下一步對該3份標本及獻血者進行追蹤，做回訪調查分析。

在TPPA梅毒確證為陽性的標本中梅毒金標試紙條檢出率高達91.04%(193/212)，說明梅毒金標試紙條與TPPA具有較高的符合率[10]，如果采用梅毒金標試紙條則可以有效降低血液報廢率，減少血液資源的浪費，建議在獻血前采用梅毒金標試紙條進行初篩，用來在獻血前淘汰一部分梅毒真陽性感染者。同時，梅毒感染既有既往感染，也有現癥感染，即TPPA+/RPR+為現癥感染，TPPA+/RPR-為既往感染，本研究中現癥感染占18.87%(40/212)，多數為既往感染人群，因為梅毒感染是可以通過有效藥物治療的，且可治愈，但其特異性抗體會長期存在[11]。實際工作中，存在一部分現癥感染者來獻血，可能是在發生危險行為后，為了自我體檢而來獻血，這為獻血者招募工作帶來了挑戰，要求工作人員進一步提高對獻血者獻血前的問詢水平，同時針對梅毒現癥感染者在回訪咨詢時可以告知其做進一步的檢測與治療，以免造成梅毒感染者的家庭內傳播及社會上傳播。

綜上所述，血液安全永遠是第一位，血液檢測方法也要不斷優化，應該是全流程覆蓋，包括獻血前檢測、獻血后常規檢測及常規檢測后的結果分析。因此，可以采用不同檢測方法與技術，即在獻血之前有必要進行梅毒金標試紙條檢測，淘汰一部分梅毒感染者，這可以在一定程度上減少因梅毒陽性而導致的血液報廢；在常規檢測中要選擇靈敏度和特異度較高的ELISA試劑，不斷優化試劑組合，盡量減少假陽性的發生,減少不必要的血液報廢；同時在采血之后針對梅毒ELISA單試劑陽性標本,通過TPPA確證試驗，有效鑒別出假陽性，為獻血者結果咨詢提供準確答復，減少獻血者心理負擔和精神困擾，提高公眾對無償獻血的信任度，為獻血者提供更好的精細化服務；將不同的檢測方法應用在血液檢測的不同階段，提高采供血機構的血液安全和服務質量，甚至可以為以后構建梅毒初篩反應性獻血者歸隊策略做好數據支持。目前全國采供血機構還沒有形成統一的梅毒初篩反應性獻血者歸隊指南，即ELISA任意1種試劑有反應性均判為不合格，屏蔽獻血資格，而在國外，在明確梅毒治愈1年后，即便特異性抗體(如ELISA檢測)呈反應性，若非特異性抗體(RPR檢測)無反應性，則獻血者仍然可以獻血。最近幾年國內大多數血站嘗試歸隊的梅毒初篩反應性獻血者人群僅僅針對TPPA陰性或不確定結果，相信隨著更多實驗室的參與，更多數據的積累，我國的獻血者歸隊策略將更加完善。