CsBLH7與CsKNAT4蛋白互作調節下胚軸細胞的伸長

摘要：CsBLH7與CsKNAT4分別屬于BELL類蛋白與KNOX類蛋白，可能與植物器官形態建成密切相關，但目前幾乎沒有關于CsBLH7與CsKNAT4蛋白互作的深入研究報道。采用酵母雙雜交初步確定CsBLH7與CsKNAT4能夠在細胞體內互作，形成BLH7-KNAT4蛋白復合物。雙分子熒光互補（BiFC）進一步確定了這種互作關系。原生質體瞬時轉染試驗結果表明，CsBLH7與CsKNAT4分別為轉錄抑制因子與轉錄激活因子。同時，針對35S：CsBLH7、35S：CsKNAT4材料的形態分析結果表明，下胚軸細胞長度分別縮短與伸長，這與它們的轉錄活性相適應。再者，35S：CsBLH7、35S：CsKNAT4遺傳材料的赤霉素合成酶基因分別下調與上調。研究結果表明，BLH7-KNAT4可能是通過調節赤霉素合成來調控下胚軸細胞長度，對揭示CsBLH7和CsKNAT4調控植物形態建成分子機理具有重要意義。

關鍵詞：CsBLH7;CsKNAT4;蛋白互作;BiFC;下胚軸細胞;轉錄活性;植物形態建成

中圖分類號： S563.301? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）06-0041-04

收稿日期：2021-06-11

基金項目：黑龍江省自然科學基金（編號：LH2020C097）;黑龍江省農業科學院國自然培育項目（編號：2019JJPY003）;黑龍江省麻類科技創新基金（編號：MLCX-20）;特色經濟作物綠色種植技術示范推廣項目（編號：KYBG-05WDL-2020001）。

作者簡介：張利國（1978—），男，黑龍江哈爾濱人，博士，助理研究員，主要從事麻類分子育種研究。E-mail：zlg86@aliyun.com。

BELL類蛋白幾乎存在于所有植物當中[1]，大麻中目前發現有13個BELL蛋白[2]。現有研究揭示，BLH1能夠調節植株花基形態，在生殖生長與營養生長的轉換節點可能發揮重要負調控功能;在擬南芥中BLH3和BLH6的轉錄活性相反，同時還可能參與調節植株葉片的形態與花期[3]。

KNOX家族作為TALE蛋白的一個亞類，也能夠從多方面參與對植物形態建成的調控。不同物種的同源BELL和KNOX蛋白可能存在不同的蛋白互作關系[4-5]。研究的前期工作基礎初步表明，CsBLH7可能與CsKNOXs家族部分成員之間存在蛋白互作關系。對比大麻的全基因組測序數據，在大麻中發現6個KNOX蛋白和13個BELL蛋白，因此確定它們之間的互作關系、調節方式，對解析大麻器官形態發生的機制是十分必要的，將是揭示CsBLH7調控基因表達分子機理的基礎與關鍵。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中植物材料為工業大麻新品種龍大麻4號，由黑龍江省農業科學院經濟作物研究所選育。龍大麻4號的THC （四氫大麻酚）含量低于千分之一，為高產高纖型工業大麻品種。

1.2 酵母雙雜交相關質粒構建與測試蛋白-蛋白互作

采用PCR方法通過對大麻cDNA進行克隆獲取BLH7和KNAT4的開放讀碼框片段。在酵母細胞中，轉入BLH7的同源異型結構域蛋白片段與 Bell-like 片段，在pvgDT3中插入BLH7與BLH10的cDNA。在缺乏Trp及缺乏Leu的培養基中篩選酵母細胞，以測試其蛋白互作關系，在缺少Ade與Leu，以及無Trp、無His的培養基中培養篩選后的株系。使用陰性對照Pgatd7SV（40）和Pgbkt （7）Lam，陽性對照是Pgatd7SV （40）與Pgbkt （7）p53。

1.3 采用雙分子熒光互補技術（BiFC）測試蛋白-蛋白互作

通過35S啟動子的調控，黃色熒光蛋白的兩端[4]分別連接BLH蛋白與KNOX蛋白形成融合蛋白，即C-KNAT4 與N-BLH7。擴增完成后，在pSAT6-nEYFP-N1中亞克隆KNAT4-YFPC、KNAT3-YFPC，在pSAT6-cEYFPN1中亞克隆BLH7-YFPN、BLH10-YFPN，參考Yoo等聚乙二醇轉染擬南芥原生質體的試驗方法[4]展開試驗，于Leica 2PS SSC 激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光成像情況。

1.4 原生質體瞬時轉染試驗

在pUC19質粒中構建35S：GD-OIPs，用于質粒提取和擴增。反式強激活作用因子Ld-Vp16，以及報告基因2 LexA-2 Gal4：Gus和2Gal4：Gus也在本試驗中應用。本試驗采用無內毒素轉染級質粒試劑盒（Abcam）進行報告質粒和效應因子的分析，至少重復進行3次生物學試驗和設置2次技術性重復，數據分析處理采用t檢驗。研究采用Gal4 DNA-binding domain和LexA DNA-binding domain，對應GD-OIPs與VP16，其可靠性已被反復證實，例如AUX/IAA蛋白[6]、OFP4蛋白[7]。

2 結果與分析

2.1 酵母雙雜交測試CsBLH7與CsKNAT4之間的蛋白互作

通過酵母雙雜交試驗測試CsBLH7與KNAT4在體內的相互作用，CsBLH7與轉錄蛋白因子的結合域連接組成融合蛋白，KNAT4與轉錄激活域形成融合蛋白。為排除目標蛋白可能的自激活活性，測試結合域蛋白-Oips與激活域蛋白-Empty蛋白互作。試驗結果表明，CsBLH7、KNAT4均無自激活活性，CsBLH7與CsKNAT4在體內存在蛋白互作關系，形成BLH7-KNAT4蛋白復合物。CsBLH7與CsKNAT4酵母雙雜交（圖1）。在缺乏Leu與缺乏Trp的培養基質中，Yeast-cell首先被選擇，在缺Leu、缺Trp、無His與無Ade的培養基質中培養5～6 d，完成BLH-KNOX蛋白-蛋白互作測試。

2.2 雙分子熒光互補（BtFC）研究BLH7與KNAT4蛋白互作

由于酵母雙雜交技術上的局限性，為進一步證實BLH7與KNAT4在細胞體內的蛋白互作，采用雙分子熒光互補方法進行測試。試驗采用擬南芥葉肉原生質體，共轉染YFPC-CsKNAT4與YFPN-CsBLH7，試驗體系采用RACK1-C-EYFP作為陰性對照。BiFC試驗結果顯示，BLH7與KNAT4蛋白互作發生在細胞核中（圖2）。

2.3 BLH7與KNAT4轉錄活性測試

從原生質體瞬時轉染效應因子相對表達量可知，圖中GD-BLH7的GUS相對表達量明顯降低（圖3），GD-KNAT4的GUS相對表達量明顯上調（圖3、圖4），由此可知CsBLH7為轉錄抑制因子，CsKNAT4為激活因子，且CsBLH7能夠與CsKNAT4互作，并能夠抑制CsKNAT4的轉錄激活活性（圖5）。

2.4 CsBLH7-CsKNAT4調節下胚軸細胞的伸長

在過去針對BELL與KNOX類蛋白研究的結果表明，二者能夠調節植株的形態發育，包括葉片的形狀、莖的長度、花基發育等。對比野生型（Col），35S：CsBLH7下胚軸長度與下胚軸細胞長度明顯縮短，35S：CsKNAT4下胚軸長度明顯伸長（圖6、圖7）。

在水稻、擬南芥等植物中過去關于BELL與 KNOX蛋白的研究曾報道，BELL-KNOX通過調控赤霉素合成酶基因來調節莖與細胞的伸長。為進一步探究CsBLH7-CsKNAT4調節胚軸與莖細胞長度的機制，對不同遺傳背景材料的赤霉素合成酶基因做熒光定量分析。結果表明，35S：CsBLH7中CsGA20ox1表達量均降低，35S：CsKNAT4中CsGA20ox1表達量上升（圖8）。

3 討論

研究采用酵母雙雜交初步確定，CsBLH7與

CsKNAT4能夠在細胞體內互作，形成BLH7-KNAT4蛋白復合物，雙分子熒光互補（BiFC）進一步證實了這種蛋白互作。以擬南芥原生質體為材料，為確定轉錄蛋白的作用開展瞬時轉染，通過酶標儀以GUS基因相對表達量，確定CsBLH7為轉錄抑制因子，35S：CsKNAT4為轉錄激活因子。材料35S：CsBLH7下胚軸與細胞長度降低，材料35S：CsKNAT4下胚軸與細胞長度增加。BLH7與KNAT4互作形成BLH7-KNAT4蛋白復合物，BLH7能夠抑制莖與胚軸細胞的伸長，KNAT4能夠促進莖與胚軸細胞的發育，這與BLH7作為一個轉錄抑制因子，KNAT4作為一個轉錄激活因子的遺傳特性相適應。結合不同材料CsGA20ox1的表達量，在BLH7與KNAT4蛋白互作基礎上，暗示BLH7-KNAT4可能是通過調節赤霉素合成來調控下胚軸與莖細胞長度，從而影響下胚軸的發育。

同時，在過去的報道中，OFP等其他轉錄蛋白可能與BELL-KNOX蛋白復合物發生互作來發揮調控作用，形成OFP-BELL-KNOX復合蛋白[8-9]，本研究中KNAT4與BLH7的蛋白-蛋白互作，也可能并不是直接形成的，并不能排除是通過其他蛋白間接形成的互作，這需要通過體外蛋白互作試驗進一步來確定。

參考文獻：

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