息風定喘方對哮喘豚鼠血清VEGF、EGF、TGF-β2 的調節作用

郭思彤 尚莉麗

1.安徽中醫藥大學研究生院，安徽合肥 230038；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院兒科，安徽合肥 230031

支氣管哮喘是小兒時期易患的呼吸系統疾病，發病原因與多種細胞參與的氣道慢性炎癥相關，遷延不愈則易損傷患兒心肺功能[1]。按照2019 年全球哮喘防治創議方案，控制兒童哮喘癥狀和降低未來發作風險的首選藥物仍是糖皮質激素[2]。但有研究[3]表明約有20%的患兒哮喘并未得到控制。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、轉化生長因子β2（transforming growth factor β2，TGF-β2）是氣道慢性炎癥發作的重要因素。本課題組動物實驗研究經驗豐富[4-6]，本實驗通過建立哮喘豚鼠干預模型，觀察息風定喘方對模型豚鼠肺組織病理改變及對VEGF、EGF、TGF-β2 的影響，研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

72 只3～4 周齡體重（165±15）g 普通級的雄性豚鼠。由南京市浦口區萊芙養殖場提供[合格證號：NO.202 009237；許可證號：SCXX（蘇）2019-0005]。飼養于動物實驗中心，室內溫度（23±2）℃，相對濕度50%～70%。動物倫理批準編號：AHUCM-guinea pigs-2020007）。

1.2 藥物

息風定喘方顆粒劑（由安徽中醫藥大學第一附屬醫院提供，廣東一方制藥有限公司生產，批號：粵20160214），藥物組成：以小青龍湯為基礎加用僵蠶、地龍、全蝎。地塞米松片：0.75 mg/片（上海上藥信宜藥廠有限公司，批號：H31020793）。雞卵清蛋白（美國Sigma 公司，批號：A5253）。

1.3 試劑與儀器

VEGF、EGF、TGF-β2 試劑盒（Abcam 公司，批號：GR2021-01）。402AI 醫用超聲霧化吸入器（廣東粵華醫療器械廠有限公司，型號：WH-2000）；低溫冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司，型號：TG-16M）；酶標儀（芬蘭雷勃酶標儀，型號：MK3）；恒溫水浴鍋（Leica，型號：HI1210）；正置顯微鏡（NIKON 公司，型號：ECLIPSE Ni）。

1.4 研究方法

1.4.1 動物分組 將72 只幼齡雄性豚鼠按照隨機數字表法分為正常對照組，寒哮模型組，息風定喘方高、中、低劑量組及地塞米松組，每組12 只。

1.4.2 模型制備 依據中醫寒哮動物模型建立方法[7-9]，適應性飼養1 周后，分別于第8、15 天進行腹腔注射，造模各組注射10%卵清蛋白和氫氧化鋁混合溶液1 ml 致敏，正常對照組注射等劑量生理鹽水。第2 次腹腔注射致敏1 周后，造模各組用1%卵清蛋白溶液霧化激發哮喘，30 min/次，1 次/d，持續1 周，每次結束后將其放置于0～4℃的恒溫箱內給予寒冷刺激1 h；正常對照組霧化用等劑量生理鹽水代替。當豚鼠逐漸出現咳嗽、呼吸急促、煩躁不安等哮喘癥狀，同時有畏寒、顫抖、噴嚏、流涕等現象[10]，提示寒性哮喘模型造模成功。

1.4.3 給藥方法 造模成功后，實驗第29 天，參考《藥理實驗方法學》[11]，按人與豚鼠體表面積換算公式計算給藥劑量。息風定喘方高、中、低劑量組分別予息風定喘方顆粒劑22.72、11.36、5.68 g/（kg·d）（劑量均為每袋顆粒劑所含的中藥生藥量）。地塞米松組予0.75 mg/片規格的地塞米松0.05 mg/（kg·d）。正常對照組和寒哮模型組予生理鹽水10 ml/（kg·d）。每天固定時間段灌胃1 次，連續21 d。

1.4.4 血清VEGF、EGF 及TGF-β2 水平測定 末次給藥后予禁食24 h，造模各組最后以1%卵蛋白溶液霧化激發后取材。考慮每組均有不同原因致死（2～4 只）情況發生，每組取8 只進行實驗取材。以濃度20%的烏拉坦（1.5 g/kg）腹腔注射麻醉并完成5 ml 腹主動脈采血，離心15 min（4℃，離心半徑8.4 cm，速率3500 r/min），分離血清。采用酶聯免疫法檢測血清中VEGF、EGF及TGF-β2 水平。按照相關試劑盒提供方法操作。

1.4.5 肺組織病理變化觀察 腹主動脈采血完成后，立即取出肺組織，固定2～3 d 后依次進行脫水、包埋，切片成4～7 μm 的厚度，HE 染色后，光鏡下觀察豚鼠肺組織的病理改變。

1.5 統計學方法

采用SPSS 23.0 軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t 檢驗，兩組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

參與哮喘造模的各組豚鼠在激發階段，逐漸出現搔鼻、噴嚏，頻繁抓耳撓腮等典型哮喘癥狀。藥物干預后，豚鼠噴嚏及咳嗽癥狀改善，食量增加、體重增長速度增快，被毛光澤恢復，其中息風定喘方高劑量組豚鼠癥狀改善情況優于息風定喘方中、低劑量組。

2.2 各組肺組織病理情況

正常對照組的肺組織整體結構正常，無明顯炎癥細胞浸潤。寒哮模型組肺泡間隔增厚增寬，肺泡腔內可見大量炎癥細胞浸潤，杯狀細胞增生，氣道腔黏液增多。與寒哮模型組比較，息風定喘方各劑量組氣道改變均有減輕，有不同程度炎癥細胞浸潤，肺泡間隔厚度降低。見圖1。

圖1 各組豚鼠肺組織病理變化（HE，200×）

2.3 各組血清VEGF、EGF、TGF-β2 含量比較

與正常對照組比較，寒哮模型組血清中VEGF、EGF、TGF-β2 含量升高，差異均有高度統計學意義（P ＜0.01）。與寒哮模型組比較，息風定喘方各劑量組的VEGF、EGF、TGF-β2 含量均降低，差異有統計學意義（P ＜0.05）。息風定喘方低、中劑量組血清VEGF 含量均高于息風定喘方高劑量組，差異均有統計學意義（P ＜0.05）；息風定喘方中、低劑量組血清VEGF 含量比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。息風定喘方低劑量組血清EGF 含量高于息風定喘方高、中劑量組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。息風定喘方高劑量組與息風定喘方中劑量組血清EGF 含量比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。息風定喘方低劑量組血清TGFβ2 含量高于息風定喘方高、中劑量組，息風定喘方中劑量組血清TGF-β2 含量高于息風定喘方高劑量組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組血清VEGF、EGF、TGF-β2 含量比較（pg/ml，）

表1 各組血清VEGF、EGF、TGF-β2 含量比較（pg/ml，）

注：與正常對照組比較，aaP ＜0.01；與寒哮模型組比較，bP ＜0.05；與息風定喘方高劑量組比較，cP ＜0.05；與息風定喘方中劑量組比較，dP ＜0.05。VEGF：血管內皮生長因子；EGF：表皮生長因子；TGF-β2：轉化生長因子β2

3 討論

中醫學認為哮喘發作時主要病機為“風痰阻肺”[12]，寒性哮喘則是發病時具有氣喘咳嗽、喉間哮鳴、痰稀色白、形寒肢冷等一系列證候的病證[13]。息風定喘方是尚莉麗教授依據“內風”[14-15]理論，從“伏邪”[16]角度，以治療寒性哮喘之經方小青龍湯為主方，加僵蠶、地龍、全蝎三味蟲類藥組成的自擬方，已長期應用于臨床，并取得很好的療效。蟲類藥物因其性擅走竄、可入絡搜風、息風止痙[17]，可使肺氣宣降得宜、內風得息、氣道攣急得以緩解。現代藥理學研究也證實僵蠶、地龍、全蝎等蟲類藥有緩解支氣管痙攣，降低氣道高反應性等作用[18-20]。

VEGF 作為刺激血管生成的重要信號蛋白[21]，可使炎癥細胞從循環系統向炎癥部位遷移，幫助炎癥的發展和持續[22]。EGF 則可刺激表皮細胞等的增殖[23]，氣道組織中EGF 可在異常刺激下與高分泌的肝素結合，介導氣道重塑過程[24]。TGF-β 是支氣管哮喘發作時影響氣道重塑的重要介質，其可以促進上皮纖維化、杯狀細胞和平滑肌增生[25]。

本研究結果顯示，息風定喘方對寒性哮喘豚鼠有一定的治療作用，其可能機制是通過調節VEGF、EGF、TGF-β2 水平達到降低炎癥因子含量，抑制細胞增殖，控制氣道炎癥，改善氣道重塑的目的，從而產生療效。