堿性成纖維細(xì)胞生長因子對(duì)腫瘤壞死因子-α聯(lián)合放線菌酮協(xié)同誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

熊成浩 楊波 唐道琪 薛琦 方海洲 王菊芳

1.珠海億勝生物制藥有限公司，廣東珠海 519085；2.億勝生物科技有限公司，香港 999077；3.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006

[關(guān)鍵字] 堿性成纖維細(xì)胞生長因子；軟骨損傷；細(xì)胞凋亡；腫瘤壞死因子-α

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種嚴(yán)重影響老年人健康關(guān)節(jié)性疾病[1-2]，炎癥及炎癥引起的關(guān)節(jié)軟骨損傷與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系[3-4]。近來的研究發(fā)現(xiàn)堿性成纖維細(xì)胞因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）在軟骨、神經(jīng)及心肌修復(fù)等過程中扮演重要的角色[5-7]。盡管已有研究報(bào)道，bFGF 可以通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生長，分化及胞外基質(zhì)的合成修復(fù)損傷的軟骨組織[8]，但是bFGF 對(duì)炎癥條件誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用目前并不明確，本研究旨在利用腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和放線菌酮（cycloheximide，CHX）聯(lián)合誘導(dǎo)的體外軟骨細(xì)胞炎癥損傷模型，探究bFGF 對(duì)于軟骨細(xì)胞在炎癥環(huán)境下的保護(hù)作用及機(jī)制，為bFGF 在軟骨損傷修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

膝關(guān)節(jié)來源的人原代軟骨細(xì)胞（4650）購自美國ScienCell 公司，采用人軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基（4651，Scien-Cell 公司）進(jìn)行培養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞均使用P3 代細(xì)胞。

1.2 主要試劑和儀器

bFGF（珠海億勝，批號(hào)：200505）；TNF-α（南京金斯瑞生物科技股份有限公司，Z01001），凋亡試劑盒（BD，556547），JC-1 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，C2006）；MTT（Sigma，M5655）；放線菌酮（上海翊圣生物科技有限公司，40325ES03）；兔抗鼠Bcl-2和Bax 抗體（CST，3498T、5023T）；二氧化碳培養(yǎng)箱（NuAire，NU-5810E）；流式細(xì)胞儀（貝克曼，CytoFlex）；化學(xué)發(fā)光曝光儀（GE；Amersham Imager 680）。

1.3 軟骨細(xì)胞損傷模型的建立

96 孔板每孔接種1.0×104個(gè)細(xì)胞，待匯合度達(dá)到70%時(shí)棄去上清，給藥組中加入含有1 μmol/L CHX及10、20、50 ng/ml TNF-α 的完全培養(yǎng)基，對(duì)照組加入100 μl 完全培養(yǎng)基（無CHX 及TNF-α）。將孔板放置到培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.4 細(xì)胞活力的檢測(cè)

96 孔板每孔接種1.0×104個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞生長至匯合度達(dá)到70%時(shí)棄去上清，模型組加入含有1 μmol/L CHX 和50 ng/ml TNF-α 的完全培養(yǎng)基，bFGF 低劑量和高劑量給藥組在模型組給藥的基礎(chǔ)上分別給予1 ng/ml 和10 ng/ml 的bFGF，對(duì)照組給予等體積的完全培養(yǎng)基，48 h 后用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.5 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

12 孔板每孔接種1.0×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行給藥。給藥組別的設(shè)置與“1.4”一致，藥物處理48 h 后，使用流式檢測(cè)試劑盒對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行染色，隨后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡。

1.6 線粒體損傷的檢測(cè)

12 孔板每孔接種1.0×105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行給藥。給藥組別的設(shè)置與“1.4”一致，48 h 后收集細(xì)胞，JC-1 染色后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 Bcl-2 和Bax 凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)

12 孔板每孔接種1.0×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行給藥，給藥組別的設(shè)置與“1.4”一致，24 h 后用RIPA 裂解液充分裂解細(xì)胞后收集總蛋白提取液。對(duì)總蛋白進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗和二抗、漂洗后進(jìn)行顯影，采用Image J 7.0 軟件對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t 檢驗(yàn)或方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α 聯(lián)合CHX 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷的模型建立

1 μmol/L CHX 聯(lián)合10、20、50 ng/ml TNF-α 的實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞活力[（72.85±9.38）%、（67.88±1.25）%、（56.95±4.82）%]低于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.870，P ＜0.001）。當(dāng)TNF-α 為50 ng/ml 時(shí)，細(xì)胞活力下降約一半，為較為適宜的誘導(dǎo)劑量。因此，采用1 μmol/L CHX 聯(lián)合50 ng/ml 的TNF-α 建立軟骨細(xì)胞損傷模型。

2.2 bFGF 對(duì)TNF-α/CHX 損傷的軟骨細(xì)胞活力的影響

bFGF 低劑量和高劑量組的細(xì)胞活力[（77.34±7.23）%、（86.51±6.48）%]與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.218，P ＜0.05；t=5.501，P ＜0.01）。見圖1。

圖1 不同給藥組別軟骨細(xì)胞的細(xì)胞活力比較（n=3）

2.3 bFGF 對(duì)TNF-α/CHX 損傷的軟骨細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，模型組凋亡率明顯升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.87，P ＜0.001），而bFGF 低劑量和高劑量組凋亡率低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.320，P ＜0.05；t=5.415，P ＜0.01）。見圖2、表1。

圖2 流式檢測(cè)各給藥組軟骨細(xì)胞的凋亡情況

表1 不同組別軟骨細(xì)胞凋亡率比較（%，，n=3）

表1 不同組別軟骨細(xì)胞凋亡率比較（%，，n=3）

注 與對(duì)照組比較，aP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。bFGF：堿性成纖維生長因子

2.4 bFGF 對(duì)軟骨細(xì)胞線粒體損傷的影響

模型組細(xì)胞FITC 陽性細(xì)胞比率高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.41，P ＜0.001）。而bFGF的給藥可以降低FITC 的陽性細(xì)胞比率，高劑量bFGF 組FITC 陽性細(xì)胞比率低于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.684，P ＜0.01）。見圖3、表2。

表2 不同組別細(xì)胞JC-1 染色后FITC 陽性細(xì)胞比率比較（%，，n=3）

表2 不同組別細(xì)胞JC-1 染色后FITC 陽性細(xì)胞比率比較（%，，n=3）

注 與對(duì)照組比較，aP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.01。bFGF：堿性成纖維生長因子

圖3 JC-1 染色檢測(cè)各組別軟骨細(xì)胞線粒體的損傷情況

2.5 bFGF 對(duì)Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)水平的影響

模型組細(xì)胞Bcl-2 的表達(dá)水平低于對(duì)照組，Bax的表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.863，P ＜0.01；t=7.357，P ＜0.01）。但是在給予bFGF后，高劑量組Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.838，P ＜0.05）；低劑量組和高劑量組Bax 蛋白的表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.198，P ＜0.05；t=4.726，P ＜0.01）。見圖4、表3。

圖4 Western blot 檢測(cè)軟骨細(xì)胞線粒體損傷和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 和Bax 的表達(dá)

表3 不同組別細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax 表達(dá)水平比較（%，，n=3）

表3 不同組別細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax 表達(dá)水平比較（%，，n=3）

注 與對(duì)照組比較，aP ＜0.01；與模型組比較，bbP ＜0.01，bP ＜0.05。bFGF：堿性成纖維生長因子

3 討論

TNF-α 是一種多功能的炎癥細(xì)胞因子，主要來源于巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等[9-11]。體外培養(yǎng)的條件下，炎癥因子對(duì)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞活力無明顯影響，致敏劑CHX 可以抑制細(xì)胞內(nèi)cFLIP 生成，與炎癥因子聯(lián)用可以有效地誘導(dǎo)細(xì)胞損傷[12-13]。Lee等[14]采用CHX 與TNF-α 聯(lián)用誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷，建立了軟骨細(xì)胞炎癥損傷模型。在本研究中，1 μmol/L CHX 存在的條件下，TNF-α 可以明顯地降低軟骨細(xì)胞的活力，并且具有劑量依賴的趨勢(shì)，當(dāng)TNF-α 為50 ng/ml 時(shí)細(xì)胞活力接近50%，為較為適宜的誘導(dǎo)劑量，因此選擇該條件作為建立軟骨細(xì)胞損傷模型的條件。

bFGF 具有組織修復(fù)、血管生成及神經(jīng)營養(yǎng)等生物學(xué)功能[15-18]。Li等[19]研究結(jié)果顯示，關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨組織中bFGF 的缺失可以明顯促進(jìn)軟骨的凋亡和壞死。此外，體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示10 ng/ml 的bFGF 可以強(qiáng)烈促進(jìn)人原代軟骨細(xì)胞的增殖，上調(diào)軟骨細(xì)胞膠原蛋白和蛋白聚糖的表達(dá)[20]，這些研究顯示bFGF 對(duì)軟骨增殖，分化和存活等具有重要的影響。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，bFGF 能有效上調(diào)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞活力，提示bFGF 對(duì)軟骨細(xì)胞的損傷具有明顯的保護(hù)作用。

近年來的研究顯示，bFGF 可以抑制凋亡、自噬等多種途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)各種細(xì)胞的保護(hù)作用。Liu等[21]研究顯示在U251 細(xì)胞中，bFGF 的敲減可以降低線粒體的膜電位，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果也顯示，bFGF可以有效地保護(hù)線粒體的功能，抑制模型細(xì)胞的凋亡。Bcl-2 和Bax 是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白[22]，Tong等[23]研究顯示在缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型中，bFGF 可以顯著抑制模型細(xì)胞Bax 的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2 的表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這與本研究結(jié)果具有一定的相似性，而bFGF 的這一作用也在神經(jīng)細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和腎臟細(xì)胞的相關(guān)研究中得到了證實(shí)[24-26]。

綜上所述，bFGF 可以通過抑制線粒體膜的損傷，保護(hù)線粒體的功能，調(diào)控線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bax 和Bcl-2 的表達(dá)等機(jī)制抑制軟骨細(xì)胞的炎癥損傷，具有一定的治療前景。