烏藥matK基因的生物信息學及多樣性分析

袁莉霞，王芙蓉，劉 姝，孫 妍，樓天靈

（浙江醫藥高等專科學校，浙江 寧波 315100）

烏藥［Lindera aggregate（Sims）Kosterm］為新“浙八味”之一，因產于浙江天臺，故名臺烏藥，其塊根有行氣止痛、降脂、護肝等功效［1，2］。由于道地烏藥的使用量日趨增多，且缺乏集中化保護，使得道地烏藥蘊藏量日趨減少，因此集約化管理迫在眉睫。據《本草綱目》記載，“其直根者不堪用”［3］，且其生長年份較長，因此在種質選取中存在較大難度。

DNA條形碼技術已廣泛用于各物種分類鑒定、親緣性及多樣性分析等。該技術不受形態和發育狀態的影響，準確度高，分類依據可靠，在植物鑒定中已取得顯著成效［4-6］。matK為植物DNA條形碼的標準序列之一，能夠有效對植物屬間及屬以上級別進行鑒定［7］，對近緣性物種也有較好的分辨能力［8］。滕艷芬等［9］通過分析同屬間5種石斛的葉綠體matK基因序列，成功將正品與混淆品區分開。劉靜等［10］通過不同的石斛及密花石豆蘭的matK序列分析發現，matK基因可用于種及變種之間的鑒別。鄭輝等［11］以ITS2+matK序列對峨眉山區唇形科藥用植物進行鑒定，發現ITS2+matK序列能夠快速、準確鑒定并闡明物種之間的親緣關系。Alaklabi等［12］利用葉綠體matK和質體rbcL基因進行研究發現，該基因序列可用于蘆薈及其近緣物種的鑒定。王瑞嫻等［13］利用matK序列對7份桑葉進行聚類分析，結果表明桑樹品種間的遺傳多樣性低于其他植物。

目前，matK基因在烏藥鑒定中的應用尚未見報道。本研究從生物信息學角度對烏藥matK基因編碼蛋白進行分析，并通過序列聚類方法，完成遺傳進化及多樣性分析，為烏藥種質資源鑒別、分類及多樣性研究提供參考。

1 材料方法

1.1 試驗材料

從NCBI獲取的11種山胡椒屬matK基因序列為研究對象，這11個物種分別為烏藥（Lindera aggregata），登 錄 號：AB442057.1；桂 皮 釣 樟（Lindera benzoin），登錄號：MG220997.1；香葉樹（Lindera communis），登錄號：AF244405.1；綠葉甘植（Lindera fruticosa），登錄 號：AF244405.1；黑殼 楠（Lindera megaphylla），登錄號：AF244404.1；滇粵山胡椒（Lindera metcalfiana），登錄號：AF244403.1；三椏烏藥（Lindera obtusiloba），登錄號：AF244402.1；山橿（Lindera reflexa），登錄號：AF244401.1；天全釣樟（Lindera tienchuanensis），登錄號：AF244399.1；山胡椒（Lindera glauca），登錄號：AB442056.1；三股筋香（Lindera thomsonii），登錄號：AF244400.1。

1.2 數據分析

利用NCBI ORFfinder在線工具對烏藥matK基因進行分析，通過DNAman軟件和ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預測編碼氨基酸；利用Protscale（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl？1）、SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）及TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析烏藥matK蛋白的親/疏水性、信號肽及跨膜結構域；利用GOR IV（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl）和SWISS-MODEL（http：//www.swissmodel.expasy.org/）預測烏藥matK蛋白的二、三級結構；運用MEGA7軟件對烏藥等11種matK基因序列構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 開放閱讀框及氨基酸預測

利用NCBI ORFfinder對烏藥matK基因的開放閱讀框進行分析，結果如圖1所示。烏藥matK基因序列長度為1 628 bp，包含14個開放閱讀框，其中ORF1的長度為1 545 bp，起始密碼子位于1 bp的位置，終止密碼子位于1 524 bp的位置。利用DNAman對matK基因編碼的氨基酸序列進行預測，結果顯示其所編碼的氨基酸個數為507個（圖2）。

圖1 烏藥matK基因的開放閱讀框分析

圖2 烏藥matK基因及編碼氨基酸序列

通過ProtParam分析發現，烏藥matK的分子式為C2757H4209N743O735S12，相對分子質量為59 839，其中Leu占比最高，為12.23%（62/507）；其次為Ser、Ile和Phe，分 別 為11.64%（59/507）、8.28%（42/507）和8.09%（41/507）；Met和Cys占比最低，均為1.18%（6/507）（圖3）。

圖3 烏藥matK的氨基酸組成

2.2 理化性質預測

烏藥matK的一級結構分析發現存在極性氨基酸，這些氨基酸對高級結構一定有影響。利用Protscale對編碼的氨基酸序列進行親/疏水性分析，結果表明該蛋白的親水指數為-0.200，為親水蛋白（圖4）。利用SignalP4.1對matK序列的信號肽預測分析發現，該蛋白第8號位上的氨基酸S值最大，為0.486；第21號位上Y值和C值均最大，分別為0.307和0.242；S值平均為0.385，小于0.5，這表明該蛋白不存在信號肽（圖5）。通過對matK跨膜預測發現，該蛋白膜內外的比例為100∶1（圖6），表明該蛋白不具備細胞間信號傳遞的能力。

圖4 烏藥matK的親/疏水性

圖5 烏藥matK的信號肽預測

圖6 烏藥matK的跨膜結構預測

2.3 二、三級結構預測

通過GOR IV分析發現，在烏藥matK的二級結構中，α-螺旋（H）為182個，占35.90%；延長線（E）為75個，占14.79%，隨機線圈（C）為250，占49.31%（圖7）。通過SWISS-MODEL對烏藥matK三級結構預測發現，在三級結構中，隨機線圈分布最多，其次為Alpha螺旋，這與二級結構的預測結果相一致（圖8）。

圖7 烏藥matK的二級結構

圖8 烏藥matK的三維結構

2.4 系統進化樹

以NCBI中獲取的11種matK基因序列為對象，通過MEGA7軟件構建進化樹（圖9），結果表明，該進化樹主要分為3個類群，烏藥（Lindera aggregata）與椏烏藥（Lindera obtusiloba）、三股筋香（Linderathomsonii）在第2個類群，表明烏藥與這2個物種間親緣性較高；山胡椒（Lindera glauca）與烏藥親緣關系最遠。

圖9 烏藥matK基因的系統進化樹

3 小結與討論

matK基因進化速度與rbcL基因相比較慢，而略快于ITS，是目前最常用的DNA條形碼序列，已被廣泛應用于中藥鑒定［14-16］。林曉霞等［17］通過matK和rbcL序列對采集到的22份鐵皮石斛進行了系統進化分析和種質的鑒定，結果發現matK分析得到的系統進化關系具有更高的遺傳多樣性；Asahina等［18］通過matK和rbcL序列對石斛進行鑒定，同樣發現rbcL序列的鑒定能力不如matK序列。熊哲銘等［19］通過matK序列對5種陰地蕨屬（Botrychium）藥用植物進行了種間親緣關系分析。目前，尚未見matK基因在烏藥上的研究。

本研究發現，烏藥matK基因所編碼的蛋白開放閱讀框大小為1 545 bp，編碼的氨基酸有20種，共507個，其中占比最高的氨基酸為Leu，最低的為Met和Cys。該蛋白不穩定指數為52.66，親水指數為-0.200，為親水蛋白。該蛋白不存在信號肽，且不具備細胞間信號傳遞的能力。此外，通過11種山胡椒屬matK基因的進化樹結果發現，烏藥與三股筋香的親緣性最高，與山胡椒的親緣性最遠。該研究可為烏藥的種質資源鑒別及系統進化分析提供參考依據。