卵黃抗體在水產養殖病害防治中的應用

俞晶晶 ，蕭槍槍 ，鄭晨陽 ，趙軒 ，林晨韜 ，3*

（1.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117；2.福建師范大學南方海洋研究院，福建省特色海洋生物資源可持續利用重點實驗室，福建 福州 350117；3.福建師范大學海洋生物醫藥與制品產業化開發技術公共服務平臺，福建 福州 350117）

我國作為水產養殖大國，每年的水產品產量約占世界水產養殖產量的70%，位居世界第一，也是世界上唯一養殖量大于捕撈量的國家。但由于水產動物的集約化養殖，導致水環境日益惡化，水產動物病害頻繁發生，造成了巨大的經濟損失，因此防控和治療水產動物疾病十分重要。抗生素能有效地防治水產養殖中的細菌性疾病，但長期使用后，也暴露出病原菌產生耐藥性及藥物殘留等問題，濫用抗生素不僅污染水體還會危害人體健康。2020 年7 月國家頒布了飼料“禁抗令”，禁止飼料中添加含促生長類藥物，禁令的實施促進了抗生素替代品的研制。目前常見的抗生素替代品有益生菌、中草藥、噬菌體、免疫糖類、飼料酶制劑以及卵黃抗體（IgY）等，其中卵黃抗體因具有不產生耐藥性、制備簡單、產量大、穩定性好、符合動物福利要求、不激活哺乳動物的補體系統等優勢，越來越受到人們的關注。

卵黃抗體是一種免疫球蛋白，主要存在于禽類、兩棲動物以及爬行動物的血清中，目前研究最多的是雞的卵黃抗體。1893 年，Klemperer首次證實了對破傷風毒素的免疫力可以從母雞身上轉移到小雞身上，即蛋雞經過抗原免疫后，產下雞蛋的蛋黃中存在特異性抗體。1969 年，Leslie 等對雞的免疫球蛋白結構和功能進行研究后，將其命名為卵黃抗體。隨著科研技術的發展以及生產領域的擴大，人們對抗體的需求量越來越大，也更重視對實驗動物的保護，卵黃抗體逐漸被科研人員注意到，其相關研究報道也越來越多。近年來，卵黃抗體技術與基因工程技術、免疫檢測技術、磁珠技術、噬菌體展示技術等多種當前主流的抗體技術相結合，應用于病原體檢測和診斷、動物疾病治療、食品工程、新藥研發以及快速大量生產科研用抗體等方面。現從卵黃抗體的基本特性及其在水產養殖病害防治中的應用等方面進行歸納總結，以期為今后卵黃抗體的研究及應用提供參考。

1 卵黃抗體的基本特性

1.1 分子生物學特性及理化性質

卵黃抗體由2 條相同的重鏈和2 條相同的輕鏈組成，通過二硫鍵進行連接，分子質量約為1.8×10u，其中重鏈分子質量約為6.5×10u，輕鏈的分子質量約為 2.5×10u，輕鏈由 1 個可變區（V）和1 個恒定區（C）組成，重鏈由 1 個可變區（V）和 4個恒定區（C，C，C，C）組成。卵黃抗體的重鏈沒有鉸鏈區，所以抗原結合活性會受到一定的影響，還可能存在空間阻位，但這恰好增加了它的穩定性，因此卵黃抗體具有較好的耐熱、耐酸和耐酶解的能力。卵黃抗體的等電點約為5.1，由于卵黃抗體處在富含脂質的環境中（蛋黃），因此其疏水性較高。

卵黃抗體的活性可受溫度、pH 值和消化酶的影響。溫度為60~65 ℃時，卵黃抗體生物活性稍稍降低，溫度 >70 ℃時，15 min 后卵黃抗體活性會明顯下降。一般而言，低溫狀態下，抗體活性變化較小，卵黃抗體可長期保存。研究結果顯示，溫度為4 ℃時，卵黃抗體可保存5 年，室溫下則可保存6 個月。此外，在卵黃抗體中加入葡萄糖、甘露糖等糖類，可增加卵黃抗體的熱穩定性。pH 值對卵黃抗體的活性影響表現為4.011.0 時，其活性下降較為明顯。此外，酸性條件下加入巖藻糖或者山梨醇可使卵黃抗體的活性不受影響。與其他蛋白質一樣，卵黃抗體也會受到蛋白水解酶的影響。研究結果顯示，pH 值及酶與底物的比例會影響卵黃抗體對胃蛋白酶的敏感性，另外在胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化8 h 后，卵黃抗體仍能保留部分活性。

1.2 卵黃抗體的產生及作用機理

當禽類受到外來抗原的免疫刺激后，法氏囊中的B 淋巴細胞就會分化成為漿細胞，分泌特異性抗體進入血液循環，當血液流經卵巢時，特異性抗體通過識別結合到卵黃膜表面受體上，通過主動轉運的方式轉移到蛋黃中并積累，從而形成卵黃抗體。目前，已報道的特異性卵黃抗體受體主要有3 種，分別為 FcRY、CHIPR-AB1 和 ggFcR。

卵黃抗體可抑制特定病原菌的生長，但其作用機制一直存在爭議。目前，被認可的作用機制主要為以下5 種。（1）卵黃抗體直接作用于細菌細胞壁，使其細胞的完整性遭到破壞，從而抑制病原菌的生長，Xu 等研究顯示，相較于非特異性卵黃抗體，用特異性卵黃抗體處理過的愛德華氏菌2CDM001 表面結合了更多的免疫金顆粒，且空白對照組中細菌表面未發現免疫金顆粒。這較好得證實了該作用機制；（2）卵黃抗體直接作用于細菌菌毛，使病原菌不能黏附細胞，從而阻斷感染。Wang 等研究結果顯示，感染大腸埃希菌K88 的仔豬口服特異性卵黃抗體后，黏附在其空腸和回腸上的細菌數量顯著減少，因此認為，特異性卵黃抗體能夠阻止大腸埃希菌K88 黏附在仔豬的空腸和回腸黏膜上，并可顯著減少結腸內容物中大腸埃希菌數量和腸毒素表達；（3）卵黃抗體可增強巨噬細胞的吞噬活性，幫助機體更有效地清除有害物質。Qin 等研究結果顯示，特異性卵黃抗體可通過增強誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和還原型輔酶Ⅱ（NADPH）吞噬細胞氧化酶的表達來增加巨噬細胞介導的呼吸爆發，即增加一氧化氮和超氧陰離子的產生，從而保護宿主免受微生物侵襲。（4）卵黃抗體可作用于病原菌產生的內毒素（LPS）。LPS 是革蘭氏陰性菌代謝過程中分泌的一種外膜物質，可以引起發熱、細胞及組織損傷、休克甚至死亡等；（5）卵黃抗體可在消化酶的作用下分解為小肽，并結合于病原菌的黏附因子，使得病原菌不能黏附易感細胞，進而喪失致病性。

1.3 卵黃抗體的分離提取和純化

雞的卵黃中主要成分為水、脂肪和蛋白質，其占比分別為48%，30.5%和17.8%，其中蛋白質與脂肪結合形成脂蛋白，不與脂肪結合則為水溶性蛋白，水溶性蛋白包括α、β 和γ 3 種活性蛋白，卵黃抗體為γ 活性蛋白。從卵黃中獲得卵黃抗體包括分離和提取，其中分離的原理是去除卵黃中的脂肪以及脂蛋白，獲得水溶性組分，常用的分離方法有水稀釋法、三氯甲烷萃取法和聚乙二醇法等。提取則是將大量的卵黃抗體從水溶性組分中提取出來，常用的提取方法為水稀釋法和硫酸銨沉淀法。為了滿足不同的使用目的，可將提取出來的卵黃抗體進行純化，常見方法有離子交換法、凝膠過濾法和親和層析法等。

2 卵黃抗體在水產養殖病害防治中的應用

目前，我國水產養殖病害種類有200 多種，常見病害有幾十種，其中細菌性疾病占比為57.63%，病毒性疾病占比為11.02%。在水產養殖病害防治中，卵黃抗體對細菌性和病毒性疾病都有很好的防治作用。卵黃抗體使用方式包括口服、注射和浸泡，根據不同的情況可選擇不同的使用方式，以達到最好的免疫效果。其中注射的方式最直接，可提高血清中的抗體水平，在防治感染消化道致病菌時，口服的效果則最好。

2.1 卵黃抗體防治水產動物細菌性疾病

在水產養殖過程中，水產動物易受到創傷弧菌、遲緩愛德華氏菌、副溶血性弧菌、鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、燦爛弧菌、溶藻弧菌等細菌的侵害，從而引發細菌性疾病。Qin 等研究結果顯示，抗嗜水氣單胞菌卵黃抗體可預防團頭魴感染嗜水氣單胞菌，同時在治療性試驗中也有較好的效果；Xu 等在大菱鲆的飼料中添加微囊化的抗遲緩愛德華氏菌卵黃抗體，可預防大菱鲆感染遲緩愛德華氏菌；海參腐皮綜合征是養殖海參過程中常見且嚴重的疾病，發病初期常以細菌感染為主，且其病原菌還具有多樣性和地域性。Xu 等研究結果顯示，對海參腹腔注射黃海希瓦氏菌AP629 后，通過注射和喂食特異性卵黃抗體都能夠顯著降低其死亡率。關于卵黃抗體防治水產動物細菌性疾病的研究報道，見表1。

表1 卵黃抗體在水產動物細菌性疾病中的應用（部分）

續表

2.2 卵黃抗體防治水產動物病毒性疾病

異育銀鯽易受到鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）的感染，爆發鰓出血病，造成大量死亡?？芎Ｑ嗟葹榉乐萎愑y鯽的鰓出血病，利用原核表達系統產生具有免疫原性的重組CyHV-2-ORF72 衣殼蛋白，將其作為抗原免疫蛋雞，后獲得具有高效價抗體的雞蛋，并采用微包膜和凍干技術將免疫蛋制成全蛋粉。對已發病的異育銀鯽投喂添加抗CyHV-2-ORF72 的免疫全蛋粉的飼料，發現添加抗CyHV-2-ORF72 的免疫全蛋粉的試驗組異育銀鯽的成活率顯著高于未添加的對照組。病毒性神經壞死?。╒NN），也稱病毒性腦病和視網膜病，其主要傳染病原是神經壞死病毒。該病在全球多種海水和淡水魚類流行，且在魚苗期的致死率可達100%，被認為是最嚴重的病毒性疾病之一。伊麗竹克隆并表達赤點石斑神經壞死病毒（RGNNV）的重組衣殼蛋白，并將其作為抗原免疫蛋雞制備抗RGNNV 特異性卵黃抗體，后將卵黃抗體-病毒混合液感染石斑魚鰭條細胞（GF-1），經Western blot 分析后發現，特異性抗RGNNV 的卵黃抗體可抑制病毒在GF-1 細胞中的復制，保護GF-1 細胞免受病毒感染。白斑綜合征病毒（WSSV）感染養殖蝦會出現高死亡率，其是由VP28、VP19 和VP15 基因編碼主要致病蛋白。Lu等利用基因重組技術將 VP28、VP19 和 VP15 串聯表達制成DNA 疫苗，用其免疫蛋雞獲得特異性卵黃抗體，另外還以滅活的WSSV 作為抗原免疫蛋雞獲得特異性卵黃抗體。結果顯示，用滅活WSSV或DNA 疫苗免疫產生的特異性卵黃抗體處理的試驗組其存活率分別為73.3%和33.3%，陽性對照組則在7 d 內全部死亡。盧亞楠進一步探究了抗WSSV 特異性卵黃抗體的被動免疫保護效果，研究結果顯示，注射、口服和浸泡3 種給藥方式均對免疫動物產生保護，此外，DNA 疫苗卵黃抗體的保護效果較滅活疫苗卵黃抗體的保護效果差。綜上研究均顯示，卵黃抗體對防治水產動物病毒性疾病有較好的效果。

3 結語

卵黃抗體作為一種綠色有效的抗生素替代品，在水產養殖病害防治中有著良好的應用前景，但實際應用過程中仍存在較多問題。首先大多數試驗都證明卵黃抗體對革蘭氏陰性菌有效，但對革蘭氏陽性菌抑制效果的報道較少，這使得卵黃抗體的使用范圍受到限制；其次，制備高質量的卵黃抗體的成本要遠高于使用常規抗生素的成本，因此需要找到一種既能降低生產成本又能提高卵黃抗體質量的方法；再次，對于卵黃抗體的商品化生產，沒有規范的操作過程和統一的質量標準。今后隨著對卵黃抗體研究的逐漸深入，將上述問題解決后，卵黃抗體有望得到廣泛應用。