養殖水產品中氯霉素殘留量的測定

張倩玉，王磊，于盟盟，梁娟

（日照市海洋與漁業研究院，山東 日照 276826）

氯霉素是一種高效廣譜的抗生素，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較好的抑制作用，曾被廣泛用于水產養殖行業。但氯霉素對人體有較強的毒副作用，長期食用氯霉素殘留量超標的水產品，可引起人肝臟和骨髓造血機能的損害，導致再生障礙性貧血和血小板減少、肝損傷等病癥。此外，氯霉素還會引起腸道菌群失調，導致消化機能紊亂。歐美等發達國家及中國先后頒布了禁止在動物源性食品中使用此類藥物的禁令。

目前，氯霉素殘留量的檢測方法主要有：氣相色譜法、氣相色譜-質譜法、液相色譜法、液相色譜-質譜法和酶聯免疫吸附法等。酶聯免疫吸附法由于其抗原抗體的活性易受到溫度、濕度和試劑盒批次的影響，重現性較差，只適用于大批量樣品的篩選，不能用于定量；液相色譜法的靈敏度則達不到測定要求；氣相色譜法和氣相色譜-質譜法的樣品前處理過程繁瑣，耗時長，易出現回收率較低的問題；高效液相色譜-質譜法樣品前處理過程簡單，重現性好，靈敏度高，是測定氯霉素的首選方法。現在文獻[7]的基礎上，對樣品前處理方法和色譜條件進行優化，利用超聲提取和內標法定量。優化后的測定方法適用于刺參、大菱鲆、南美白對蝦、三疣梭子蟹、鯉等水產品中氯霉素殘留量的快速測定，該方法回收率和靈敏度均滿足測定要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 液相色譜儀、Agilent 6460A 三重四級桿質譜儀（均為安捷倫科技有限公司）；PL202-L電子精密天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；SQP 電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；TG16-WS 臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；渦旋混合器（美國Talboys 公司）；超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；水浴氮吹儀（上海安譜實驗科技股份有限公司）；超純水器（上海摩勒科學儀器有限公司）。

乙酸乙酯、正己烷、甲醇（色譜純，美國ACS）；氯霉素、氘代氯霉素標準品（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；氫氧化銨（25%~28%，優級純，西隴化工股份有限公司）；實驗室用水均為超純水。標準儲備溶液濃度為100 mg/L，配制方法為準確稱取（10.0±0.1）mg 氯霉素標準品，用甲醇溶解并定容至100 mL，-18 ℃保存。中間濃度標準溶液濃度為20 μg/L，配制方法為移取10 μL 標準儲備液于50 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋定容至50 mL。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品提取

大菱鲆、刺參、南美白對蝦、三疣梭子蟹和鯉均取自日照當地養殖場。

分別稱取經絞碎后的大菱鲆、刺參、南美白對蝦、三疣梭子蟹、鯉樣品5.00 g 于50 mL 聚丙烯離心管中，依次加入0.20 mL 濃度為100 μg/L 的內標溶液、0.45 mL 氫氧化銨和25 mL 乙酸乙酯，渦旋混合 30 s，超聲提取 30 min，4 000 r/min 離心 5 min。移取5 mL 上清液于10 mL 離心管中，于45~55 ℃水浴中氮氣吹干。

1.2.2 凈化

向離心管中加入1 mL 甲醇水溶液［V（甲醇）∶V（水）=70∶30］溶解殘留物，加入 2~3 mL 正己烷，渦旋1 min，6 000 r/min 離心 5 min，移去上層正己烷，取下層溶液過0.22 μm 濾膜，供液相色譜-串聯質譜測定。

1.3 液相色譜及質譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為ZORBAX SB-C柱，規格為2.1 mm×50 mm，粒度 1.8 μm，流量 0.3 mL/min，柱溫 35 ℃。進樣量20 μL。流動相為甲醇水溶液[V（甲醇）∶V（水）=70∶30]。

1.3.2 質譜條件

離子化模式為ESI-，干燥氣溫度325 ℃，干燥氣流量11 mL/min，霧化器壓力45 310.26 kPa，毛細管電壓4 000 V，增益電壓Delta EMV（-）200 V，其他質譜參數見表1。

表1 多反應監測離子對及質譜參數

2 結果與分析

2.1 樣品前處理優化

在樣品中加入適量乙酸乙酯后進行超聲提取，與文獻[7]中采用勻質器勻質提取相比，該操作簡單，可避免在處理批量樣品時因刀頭清洗不徹底導致的交叉污染。由于旋轉蒸發儀一次只能濃縮一個樣品，而氮吹儀可同時濃縮24 個樣品，縮短了大批量樣品前處理的時間，因此濃縮時采用水浴氮吹代替旋轉蒸發。

2.2 色譜及質譜條件優化

采用ZORBAX SB-C色譜柱進行分離，對V（甲醇）∶V（水）進行優化，分別在比例為 90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50 條件下測定，綜合考慮氯霉素的響應值和峰型，選擇的流動相比例為V（甲醇）∶V（水）=70∶30。

在ESI-模式下，先進行全掃描，確定目標化合物離子質量數，同時對毛細管出口電壓進行優化；再采用子離子掃描，確定定性離子和定量離子，并對碰撞能量進行優化。在多反應監測（Multi reaction monitor, MRM）模式下，對目標化合物進行定性和定量分析。在優化的質譜條件下，空白大菱鲆樣品中添加0.5 μg/kg氯霉素時，定量離子和內標化合物 MRM 圖見圖 1（a）（b）。

圖1 空白大菱鲆樣品中添加0.5 μg/kg 氯霉素時定量離子和內標化合物的MRM 圖

2.3 線性范圍及檢出限

分別移取適量中間濃度標準溶液，配制成濃度為 0.1，0.5，1.0，2.5 和 5.0 μg/L 的溶液，在上述色譜和質譜條件下測定，以外標和內標的濃度比為橫坐標，響應比為縱坐標繪制標準曲線，以3 倍信噪比（3 S/N）計算檢出限。線性回歸方程、相關系數和檢出限見表2。結果顯示，氯霉素在質量濃度0.1~5.0 μg/L 內呈現良好的線性關系，線性相關系數滿足理化檢測的要求（>0.99）。

表2 線性回歸方程、相關系數和檢出限

2.4 方法回收率和精密度

向未檢出目標物的樣品中分別添加0.1，0.2 和1.0 μg/kg 混合標準溶液，每個水平的添加量平行測定6 次，計算平均回收率和相對標準偏差（RSD），結果見表3，氯霉素回收率為92.0%~98.6%，RSD 為3.0%~5.1%，滿足測定要求。

表3 方法回收率和精密度結果（n=6）

3 結論

對氯霉素殘留量的測定標準方法進行了優化。水產品樣品在堿性條件下，以乙酸乙酯為提取液，以超聲提取代替勻質提取，濃縮時采用水浴氮吹代替旋轉蒸發，提高了檢測效率。同時采用高效液相色譜-串聯質譜法測定，負離子多反應監測模式檢測，內標法定量，確保了方法的回收率和準確度。本方法操作簡單，靈敏度、回收率和精密度等方法學指標均能滿足水產品中氯霉素的檢測要求，適用于鮮活水產品中氯霉素殘留量的批量測定。