KLF2、GBP5和DUSP3基因檢測對活動性肺結核病人的診斷價值

[摘要]目的探討Krüppel樣轉錄因子2（KLF2）、鳥苷酸結合蛋白5（GBP5）和雙特異性磷酸酶3（DUSP3）基因及結核（TB）評分在肺結核病人中的診斷價值。方法選取確診活動性肺結核（ATB）病人110例、肺部其他疾病（OPD）病人114例、潛伏結核感染（LTBI）病人52例及健康對照者63例作為研究對象，應用實時熒光定量PCR（RT-PCR）方法檢測各組研究對象外周血中KLF2、GBP5和DUSP3基因表達，應用受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析3組基因及TB評分在肺結核診斷中的價值。結果ATB組的DUSP3基因表達顯著高于OPD組、LTBI組及健康對照組，差異有統計學意義（χ²=145.162，Plt;0.01）。以ATB為陽性、健康對照組為陰性，ROC曲線分析顯示，DUSP3基因的曲線下面積（AUC）為0.962，診斷靈敏度96.4%，特異度84.1%;KLF2基因AUC為0.724，GBP5基因AUC為0.710;TB評分的AUC為0.929，診斷靈敏度96.4%，特異度為82.5%。且DUSP3基因在區分ATB和LTBI時，AUC為0.805，靈敏度55.5%，特異度90.4%;而KLF2、GBP5、DUSP3基因及TB評分在區分ATB和OPD時AUC均lt;0.700。結論DUSP3基因和TB評分對肺結核的診斷效能高，有望成為ATB的篩選指標。

[關鍵詞]結核，肺;潛伏性結核;基因;診斷

[中圖分類號]R521[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2022）02-0247-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.048[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20220311.1333.005.html;2022-03-1415：18：53

VALUE OF KRPPEL-LIKE TRANSCRIPTION FACTOR 2， GUANYLATE-BINDING PROTEIN 5， AND DUAL SPECIFICITY PROTEIN PHOSPHATASE 3 GENES IN DIAGNOSIS OF ACTIVE TUBERCULOSIS ZHOU Jiayu， SUI Aihua， LI Jinfeng，" WANG Fangfang， LIN Cunzhi （Department of Respiratory amp; Critical Care Medicine， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the value of Krüppel-like transcription factor 2 （KLF2）， guanylate-binding protein 5 （GBP5）， dual specificity protein phosphatase 3 （DUSP3）， and tuberculosis （TB） score in the diagnosis of active tuberculosis （ATB）. Methods A total of 110 patients with a confirmed diagnosis of ATB， 114 patients with other pulmonary diseases， 52 patients with latent tuberculosis infection （LTBI）， and 63 healthy controls were enrolled as ATB group， OPD group， LTBI group， and HC group， respectively. Quantitative real-time PCR was used to measure the expression of KLF2， GBP5， and DUSP3 genes in peripheral blood， and the receiver operating characteristic （ROC） curve was used to analyze the value of these three genes and TB score in the diagnosis of tuberculosis." ResultsThe ATB group had a significantly higher expression level of DUSP3 than the OPD group， the LTBI group， and the HC group （χ²=145.162，Plt;0.01）. With the ATB group as positive and the HC group as negative， the ROC curve analysis showed that the DUSP3 gene had an area under the ROC curve （AUC） of 0.962， with a sensiti-vity of 96.4% and a specificity of 84.1%; the KLF2 gene had an AUC of 0.724， and the GBP5 gene had an AUC of 0.710; TB score had an AUC of 0.929， with a sensitivity of 96.4% and a specificity of 82.5%. The DUSP3 gene had an AUC of 0.805 in differentiating ATB from LTBI， with a sensitivity of 55.5% and a specificity of 90.4%， while KLF2， GBP5， DUSP3， and TB score had an AUC of lt;0.700 in differentiating ATB from OPD.ConclusionThe DUSP3 gene and TB score have a high diagnostic efficiency for tuberculosis and are thus expected to become new screening indices for ATB.

[KEY WORDS]tuberculosis， pulmonary; latent tuberculosis; genes; diagnosis

結核病是由結核分支桿菌引起的慢性傳染性疾病，每年新增感染結核（TB）病人1 000萬人，是世界十大致死疾病之一，中國也是全球30個結核高負擔國家之一[1]。結核病主要傳染源是痰涂片陽性的肺結核病人，但是全球結核分支桿菌感染者多數以潛伏結核感染（LTBI）存在，而LTBI可發展為活動性結核，成為主要的傳染源[2]，早期、快速、有效地診斷肺結核和有效地篩查LTBI人群對有效控制結核病有重大意義。目前，用于診斷LTBI的方法有結核菌素試驗（TST）和γ-干擾素釋放試驗（IGRAs），但是由于接種卡介苗的影響，IGRAs在LTBI中的診斷效能更高[3-4]。QuantiFERON TB-GOLD （QFT）試驗為IGRAs方法之一，可用于區分LTBI和健康人群。既往有研究顯示，實時熒光定量PCR（RT-PCR）技術檢測結核相關基因可以用于肺結核的診斷[5-6]。SWEENEY等[7]進行的Meta分析發現，鳥苷酸結合蛋白5（GBP5）、Krüppel樣轉錄因子2（KLF2）、雙特異性磷酸酶3（DUSP3）基因在肺結核診斷中有意義，并提出TB評分可用于診斷肺結核和LTBI。本文研究外周血單個核細胞（PBMC）中KLF2、GBP5、DUSP3基因表達和TB評分在活動性肺結核（ATB）和LTBI人群中差異，并探討其在ATB中的診斷價值。

1資料和方法

1.1一般資料

本實驗采取前瞻性研究方法，研究對象來源于2019年5月1日—12月31日就診于青島大學附屬醫院呼吸與危重醫學科和青島市黃島結核病防治所病人，以及同期青島大學附屬醫院體檢中心健康體檢者。其中ATB病人110例，男性64例，女性46例，平均年齡（46.65±19.40）歲，診斷符合中華醫學會結核病學分會《肺結核診斷和治療指南》標準[8]，排除合并免疫缺陷類疾病及服用免疫抑制劑的病人。肺部其他疾病（OPD）病人114例，男性62例，女性52例，平均年齡（54.94±15.18）歲;胸部CT檢查顯示肺部有陰影，QFT試驗陰性，痰抗酸桿菌檢測連續3次陰性，有肺部疾病癥狀及體征，包括肺癌、支氣管擴張伴感染、慢性阻塞性肺疾病、機化性肺炎、結節病、細菌性肺炎、肺曲霉菌病、肺隱球菌病等。LTBI病人52例，男性30例，女性22例，平均年齡（54.03±16.18）歲;雙肺CT檢查正常，QFT試驗陽性，無結核感染癥狀、體征及病原學依據[9]。健康對照者63例，其中男性34例，女性29例，平均年齡（46.40±18.34）歲;QFT試驗陰性且無結核感染癥狀、體征，無肺部影像學改變。4組人群性別差異無統計學意義（Pgt;0.05），OPD組年齡高于ATB組和健康對照組（F=16.164，Plt;0.05）。本研究獲得研究對象或家屬的知情同意，并通過青島大學附屬醫院倫理委員會的批準。

1.2儀器和試劑

RT-PCR儀（Roche LightCycler480Ⅱ，Switzerland）;Thermo Nano Drop 2000C核酸檢測儀（Thermo Fisher Scientific，USA）;人外周血淋巴細胞分離液（Ficoll配制，天津市灝洋生物制品科技有限公司）;RNAiso Plus（Takara，Japan）;PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Erase（Perfect Real time，Takara，Japan）;TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli R NaseH Plus，Takara，Japan）;PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3研究方法

1.3.1標本采集和處理采集受檢者外周靜脈血4 mL，EDTA抗凝，采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。應用Trizol法提取PBMC總RNA，用Thermo Nano Drop 2000C核酸檢測儀檢測RNA濃度及質量。

1.3.2RT-PCR方法檢測KLF2、GBP5、DUSP3基因表達在0.2 mL反應管中加入5×gDNA Eraser Buffer 2 μL、gDNA Eraser 1 μL、Total RNA 1 ng、RNase Free H₂O至10 μL，42 ℃反應2 min;再次加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、5×PrimeScript Buffer 24 μL、RNase Free H₂O 4 μL混勻，37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，得到cDNA。RT-PCR反應體系20 μL，內含：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus，2×）10.0 μL，PCR上游和下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA 2.0 μL，滅菌水6.4 μL。PCR反應條件：預變性95 ℃、30 s，1個循環;95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個循環;融解曲線分析95 ℃、5 s，60 ℃、60 s，95 ℃，1個循環;降溫40 ℃、60 s，1個循環。反應在Roche Light Cycler 480Ⅱ RT-PCR儀中進行。反應結束后得到Ct值，以2-△Ct值（△Ct=目的基因Ct值-內參照基因Ct值）表示目的基因的表達量。以GAPDH基因作為內參照。實驗所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成，見表1。

1.3.3TB評分的計算TB評分=（GBP5基因表達+DUSP3基因表達）/2-KLF2基因表達[8]。

1.4統計學方法

應用SPSS Statistics 23軟件以及GraphPadPrism 5軟件進行統計學分析。首先應用Shapiro-Wilk檢驗分析數據是否服從正態分布，非正態分布計量資料結果以M（P₂₅，P₇₅）表示，多組數據間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Bonferroni校正多重比較的方法。應用受試者工作特征曲線（ROC曲線）下面積（AUC）評估診斷效能[7]，用Youden指數計算最佳診斷界值[10]。Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1各組KLF2、GBP5和DUSP3基因表達比較

ATB組、OPD組、LTBI組以及健康對照組KLF2、GBP5和DUSP3基因表達差異有顯著意義（χ2=26.842～145.162，Plt;0.01）。其中KLF2基因表達ATB組高于OPD組和健康對照組，差異有統計學意義（z=4.274、4.477，Plt;0.01），但OPD組、LTBI組和健康對照組比較差異無顯著意義（Pgt;0.05）。GBP5基因表達ATB組高于OPD組和健康對照組（z=2.785、5.108，Plt;0.01），OPD組高于健康對照組（z=2.770，Plt;0.01）。DUSP3基因表達ATB組高于OPD組、LTBI組和健康對照組，差異有顯著性（z=3.793～11.524，Plt;0.01），OPD組高于LTBI組（z=3.505，Plt;0.01）和健康對照組（z=8.370，Plt;0.01），LTBI組高于健康對照組（z=3.882，Plt;0.01）。見表2。

2.2KLF2、DUSP3和GBP5基因表達及TB評分的診斷效能

2.2.1區分ATB和OPD的診斷效能以ATB為陽性、OPD為陰性，繪制ROC曲線進行分析，結果顯示，KLF2、DUSP3、GBP5基因和TB評分的AUC均lt;0.700。見圖1a和表3。

2.2.2區分ATB和LTBI的診斷效能以ATB為陽性、LTBI為陰性，ROC曲線分析顯示，DUSP3基因的AUC為0.805，靈敏度為55.5%，特異度為90.4%;TB評分的AUC為0.771，靈敏度為51.8%，特異度為88.5%。見圖1b和表3。

2.2.3區分ATB和健康人群的診斷效能以ATB為陽性、健康人群為陰性，ROC曲線分析顯示，DUSP3基因的AUC為0.962，靈敏度為96.4%，特異度為84.1%;TB評分的AUC為0.929，診斷靈敏度為96.4%，特異度為82.5%。GBP5、KLF2基因的AUC分別為0.710、0.724。見圖1c和表3。

2.2.4區分LTBI和健康人群的診斷效能以健康人群為陰性、LTBI為陽性，ROC曲線診斷效能分析顯示，DUSP3基因的AUC為0.712，診斷靈敏度為59.6%，特異度為84.1%。見圖1d和表4。

3討論

目前全球有近17億人感染結核，多數為LTBI狀態，部分可發展為ATB，且結核已成為慢性傳染病中致死率最高的疾病[1]。早期診斷和治療結核感染能夠有效地改善病人預后，也是控制結核傳播的重要環節。LTBI的診斷在結核防控中起著至關重要的作用。目前診斷肺結核的方法主要包括臨床癥狀體征、影像學檢查、病原學檢查（痰涂片、痰培養、痰結核菌PCR+探針檢測）、病理檢查、免疫學檢查（TST、酶聯免疫吸附試驗、IGRAs）等[8，11]。LTBI的診斷方法包括TST和IGRAs，IGRAs具有較高的靈敏度和陰性預測值，但是由于IGRAs價格昂貴，TST仍廣泛應用[12-15]。傳統的結核診斷方法存在缺陷，TST檢測的假陽性率高[16]，痰涂片檢查的陽性率為60%～80%，但合并HIV感染者中痰涂片陽性的檢出率僅有10%～30%[12]。結核分支桿菌培養為結核感染診斷的金標準，但是培養周期長。雖然IGRAs診斷結核的準確性高于TST，但是其檢測結果受CD4⁺T淋巴細胞計數影響[17]，且不能區分ATB與LTBI[18]。目前，有研究顯示可通過檢測某些基因的表達來診斷ATB和LTBI。

本文研究對象中，OPD組的年齡高于ATB組和健康對照組，但是無證據顯示結核病的發病率及3組基因的表達量與年齡相關。本文PCR檢測結果顯示，ATB組、OPD組、LTBI組以及健康對照組KLF2、GBP5、DUSP3基因表達差異有統計學意義。KLF2基因在人類單核細胞中高表達，在類風

2期周佳玉，等. KLF2、GBP5和DUSP3基因檢測對活動性肺結核病人的診斷價值251

濕關節炎、感染性疾病、動脈粥樣硬化等疾病中有重要作用。KLF2基因可調節單核細胞的功能和分化，調節炎癥因子白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNFα）、核轉錄因子-κB（NF-κB）等，炎癥情況下循環單核細胞中的KLF2基因表達下調[19-24]。本實驗結果顯示，KLF2基因在ATB中表達上調，與SWEENEY等[7]研究結果不一致，其原因需進一步擴大樣本量進行研究。GBP5基因可誘導巨噬細胞釋放γ-干擾素促進炎癥反應[25]，炎癥時GBP5基因表達上調促進AIM2炎性體的活化及IL-1β、IL-18等炎性細胞因子的釋放[26]。LAUX等[5]研究顯示，聯合檢測外周血GBP5基因和CD64基因表達區分ATB和OPD診斷效能高。ROE等[27]研究顯示，外周血中GBP5基因表達可作為預測結核發病基因之一。本實驗結果亦顯示，GBP5基因在ATB組的表達顯著高于OPD組和健康對照組，差異有顯著性，與SWEENEY等[7]研究結果一致，但不能區分ATB和LTBI。DUSP3也稱為VH1相關磷酸酶（VHR），為一種絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化調節因子，在細胞周期調控及血管生成中起重要作用，與多種腫瘤發病及腫瘤轉移有關;也可通過調節巨噬細胞中NF-κB信號轉導產生促炎細胞因子[28-30]。本研究結果顯示，DUSP3基因在ATB組表達上調，可用于區分ATB和LTBI;LTBI組DUSP3基因表達高于健康對照組，該基因有望成為區分LTBI和健康人群的指標之一。

本文研究結果顯示，DUSP3基因表達、TB評分可以作為區分ATB和LTBI的診斷依據，二者AUC分別為0.805和0.771，特異度分別為90.4%和88.5%，但靈敏度較低;以ATB為陽性、健康人群為陰性進行ROC曲線分析，結果顯示，GBP5基因和KLF2基因表達在診斷ATB中有一定的診斷準確性，AUC分別為0.710和0.724;DUSP3基因表達和TB評分的診斷效能高，AUC分別為0.962和0.929，且具有較高的靈敏度和特異度，有望成為診斷ATB的血液標志物。本文研究預測LTBI時，DUSP3基因表達的AUC為0.712，靈敏度和特異度分別為59.6%、84.1%，以其作為診斷LTBI的指標有一定臨床意義;KLF2基因、GBP5基因表達對ATB的診斷效能和既往研究結果相似，但DUSP3基因的診斷效能明顯高于既往研究[6]。

綜上所述，KLF2基因、GBP5基因表達單獨診斷ATB的效能不高，而DUSP3基因表達有較高的診斷價值，綜合3組基因表達的TB評分具有較高的診斷準確性。本文研究標本來源于受試者的外周靜脈血，標本較痰液易獲取、污染概率更小，檢測周期短，尤其是對無痰病人，這為ATB的診斷提供了新的思路。DUSP3基因表達和TB評分用于區分ATB和LTBI有一定的臨床意義，因此DUSP3基因和TB評分有望成為ATB診斷的血液標志物之一，對ATB的早期診斷、治療有重要的意義。對于LTBI的篩查，采集受試者外周血標本操作較TST試驗方便，可降低人為因素帶來的誤差，價格也較IGRAs檢測低。DUSP3基因表達在預測LTBI時有一定效能，這為LTBI的篩查研究提供了一個新的方向。本研究存在以下缺陷：實驗樣本較少，需進一步擴大研究樣本以提高研究結果的準確性;未追蹤ATB病人經過治療后血液中相關基因表達量變化;未設置免疫缺陷組分析免疫功能對3組基因表達的影響。

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（本文編輯黃建鄉）