降鈣素基因相關(guān)肽對LPS并ATP誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活影響

[摘要]目的探討降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）對脂多糖（LPS）聯(lián)合三磷酸腺苷（ATP）誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎癥小體活化的抑制作用。方法通過檢測不同方法處理的各組細(xì)胞NLRP3蛋白含量，確定LPS聯(lián)合ATP激活小膠質(zhì)細(xì)胞最佳模型并篩選CGRP最佳作用濃度。實(shí)驗(yàn)分為對照組、模型組以及CGRP組，采用蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞NLRP3、凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（caspase-1）的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測細(xì)胞內(nèi)炎性因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）的表達(dá)。結(jié)果BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活最佳模型的制備方法為先加入100 μg/L的LPS作用12 h，再加入5 mmol/L的ATP繼續(xù)作用45 min;CGRP抑制NLRP3炎癥小體激活的最佳濃度為10 μg/L。模型組細(xì)胞NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β的蛋白表達(dá)較對照組明顯升高，CGRP組細(xì)胞上述蛋白表達(dá)較模型組明顯降低，差異均有顯著性（F=7.261～151.232，P<0.05）。結(jié)論CGRP可能通過抑制BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活，發(fā)揮抗炎神經(jīng)保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]降鈣素基因相關(guān)肽;NLR家族，熱蛋白結(jié)構(gòu)域包含蛋白3;小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞;脂多糖類;腺苷三磷酸;神經(jīng)保護(hù)

[中圖分類號(hào)]R364.5;R338[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)]2096-5532（2022）02-0229-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.053[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20220320.1554.016.html;2022-03-2209：00：53

EFFECT OF CALCITONIN GENE-RELATED PEPTIDE ON THE ACTIVATION OF NLRP3 INFLAMMASOME INDUCED BY LPS AND ATP IN MICROGLIAGUO Mi， XIANG Jianqin， ZHANG Jian， LI Zhongzheng， QIU Jiwen， CUI Yinjie （Research Center of Experimental Acupuncture Science， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 301600， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of calcitonin gene-related peptide （CGRP） on the activation of nod like receptor thermoprotein domain associated protein 3 （NLRP3） inflammatory bodies in BV2 microglia induced by lipopolysaccharide （LPS） combined with adenosine triphosphate （ATP）.MethodsBy detecting the content of NLRP3 protein in cells with different treatment methods， the best model of LPS combined with ATP activated microglia was determined， and the best concentration of CGRP was screened. The experiment was divided into control group， model group and CGRP group. The protein expressions of NLRP3， apoptpsis-associated speck-like protein containing （ASC） and cysteinyl aspartate specific protease-1 （caspase-1） were detected by Western blot; Quantitative detection of intracellular inflammatory factor interleukin-1β protein expression by enzyme-linked immunosorbent assay. ResultsThe best model of NLRP3 inflammasome activation in BV2 microglia was prepared with 100 μg/L LPS used for 12 h， and then 5 mmol/L ATP was added for 45 min; the optimal concentration of CGRP to inhibit NLRP3 inflammasome activation was 10 μg/L. Compared with the control group， the expression of NLRP3， ASC， caspase-1 and IL-1β in model group was significantly higher; compared with the model group，the expression of NLRP3， ASC， caspase-1 and IL-1β decreased significantly （F=7.261-151.232， P<0.05）. ConclusionCGRP can play an anti-inflammatory and neuroprotective role by inhibiting the activation of NLRP3 inflammatory bodies in BV2 microglia.

[KEY WORDS]calcitonin gene-related peptide; NLR family， pyrin domain-containing 3 protein; microglia; lipopolysaccha-rides; adenosine triphosphate; neuroprotection

小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮核心作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞中NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）在人類輕度認(rèn)知障礙和阿爾茲海默?。ˋD）等神經(jīng)變性疾病中發(fā)揮著重要的作用[2-3]。NLRP3作為最具有特色的炎癥小體，是胞漿內(nèi)識(shí)別受體NOD樣受體家族的一員，當(dāng)細(xì)胞受到感染、組織損傷等刺激時(shí)，被激活的NLRP3能夠通過結(jié)合凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）招募半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（caspase-1）前體形成NLRP3炎癥小體，從而促進(jìn)caspase-1前體激活成為caspase-1，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素18（IL-18）的成熟[4]。降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）是一種神經(jīng)肽類物質(zhì)，可以直接作用于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，抑制IL-1β的生成與釋放[5-7]。本團(tuán)隊(duì)前期研究顯示，CGRP可以改善脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的表達(dá)，具有神經(jīng)保護(hù)作用，但其分子機(jī)制仍不清楚[8]。NLRP3炎癥小體的激活能夠促進(jìn)大量IL-1β的產(chǎn)生，而CGRP可以抑制IL-1β的生理功能，CGRP與NLRP3炎癥小體之間可能存在著一定的聯(lián)系。為了進(jìn)一步探明二者關(guān)系，本研究采用脂多糖（LPS）與三磷酸腺苷（ATP）誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥小體激活模型，從NLRP3炎癥小體途徑探討CGRP的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，購自Santa Cruz Biotechno-logy公司。胎牛血清（Cell Signaling Technology）;LPS（愛必信）;ATP（FERMRNTAS）;β-actin（Santa Cruz Biotechnology）;CGRP抗體（北京義翹神州科技有限公司）;ASC、caspase-1和NLRP3抗體（abcam）;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）;BCA蛋白定量試劑盒（博士德生物工程有限公司）;ECL顯影液和PVDF膜（Millipore）;HRP標(biāo)記二抗（Sigma）。全波長酶標(biāo)儀（Bio-tek，ELX 800）;垂直電泳裝置（北京市六一儀器廠，DYCZ-24DN）;CO2恒溫培養(yǎng)箱（ThermoForma，form 1341）;LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)（美國UVP公司，GelDoc-It310）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代BV2小膠質(zhì)細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清和10 g/L雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液中，放于37 ℃的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長融合率80%時(shí)傳代，隔2 d傳代1次，傳代3次后且細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2LPS聯(lián)合ATP激活小膠質(zhì)細(xì)胞最佳模型確定及CGRP最佳劑量篩選將細(xì)胞分為6組，依據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)確定兩種細(xì)胞模型處理?xiàng)l件[9-11]。對照組細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng);模型1組細(xì)胞先加入100 μg/L的LPS作用12 h，然后再加入5 mmol/L的ATP繼續(xù)作用45 min;模型2組細(xì)胞先加入100 μg/L的LPS作用4 h，然后再加入5 mmol/L的ATP繼續(xù)作用45 min;CGRP1、CGRP10、CGRP100組細(xì)胞先分別用1、10、100 μg/L的CGRP預(yù)處理1 h，然后加入100 μg/L的LPS作用12 h，再加入5 mmol/L的ATP繼續(xù)作用45 min。根據(jù)NLRP3蛋白含量篩選出最佳模型和CGRP的最佳作用濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞NLRP3、capase-1、ASC蛋白表達(dá)的檢測采用蛋白免疫印跡法檢測對照組（A組）、模型組（按篩選出的最佳模型制備方法進(jìn)行處理，B組）、CGRP組（按篩選出的最佳作用濃度的CGRP進(jìn)行處理，C組）細(xì)胞中NLRP3、capase-1和ASC的含量。樣品裂解后提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，浸入脫脂奶粉封閉液中，室溫下于搖床上輕輕搖動(dòng)2 h;然后分別加入兔抗人單克隆NLRP3抗體（1∶100）、ASC抗體（1∶50）、capase-1（1∶200）抗體以及兔抗人多克隆GAPDH抗體（1∶500）4 ℃孵育過夜。TBS-T洗膜后，將膜于含對應(yīng)二抗（HRP標(biāo)記二抗）的脫脂奶粉溶液中，室溫作用1.5 h，用ECL顯影液顯影，用LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)攝像，分析條帶的光密度值。

1.2.4細(xì)胞IL-1β表達(dá)的ELISA檢測收集對照組、模型組和CGRP組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，嚴(yán)格按照IL-1β檢測試劑盒的說明進(jìn)行檢測。反應(yīng)終止后使用全波長酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組樣本吸光度值對應(yīng)的濃度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料結(jié)果以x±s表示，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊則組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法;方差不齊則組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1最佳模型與CGRP最佳作用濃度

對照組、模型1組、模型2組以及CGRP1、CGRP10、CGRP100組NLRP3蛋白表達(dá)量分別為0.215±0.003、0.394±0.006、0.303±0.002、0.054±0.000、0.036±0.000、0.047±0.000（n=3）。對照組、模型1組、模型2組NLRP3表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=7.200，P<0.05），其中模型1組NLRP3蛋白表達(dá)量最高，因此選擇模型1為最佳模型進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對照組、模型1組以及CGRP1、CGRP10、CGRP100組NLRP3表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=13.573，P<0.05），其中CGRP10組NLRP3蛋白表達(dá)量最低，因此選擇10 μg/L的CGRP進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

2.2CGRP對NLRP3、ASC、capase-1和IL-1β蛋白表達(dá)的影響

模型組細(xì)胞NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β的蛋白表達(dá)較對照組明顯升高，CGRP組細(xì)胞上述蛋白表達(dá)較模型組明顯降低，差異均有顯著意義（F=7.261～151.232，P<0.05）。表明CGRP可以抑制炎癥小體NLRP3的激活從而減輕炎癥反應(yīng)。見圖2和表1。

3討論

NLRP3炎癥小體異常活化產(chǎn)生的過度炎癥反應(yīng)與人類多種疾病密切相關(guān)，其中包括AD、脊髓損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[12-13]。已有實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在AD模型中，NLRP3基因敲除的小鼠空間記憶能力顯著提升，運(yùn)動(dòng)功能障礙與多巴胺能神經(jīng)元退行性病變得以改善[14];在脊髓損傷模型中，小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的NLRP3炎癥小體活化，并進(jìn)一步激活核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）信號(hào)通路，形成級(jí)聯(lián)式炎癥反應(yīng)，加速神經(jīng)元的死亡[15]。因此，抑制NLRP3炎癥小體的過度激活可能是預(yù)防或治療神經(jīng)炎性疾病的關(guān)鍵。

研究發(fā)現(xiàn)，體外NLRP3炎癥小體的激活需要兩個(gè)信號(hào)：信號(hào)1是指當(dāng)細(xì)胞受到LPS的刺激時(shí)，Toll樣受體4（TLR4）迅速識(shí)別，激活NF-κB通路，導(dǎo)致pro-IL-1β和NLRP3蛋白水平的上調(diào);信號(hào)2是指高濃度ATP刺激P2X7，導(dǎo)致K+外流，促進(jìn)ASC和caspase-1的集合，從而導(dǎo)致NLRP3炎癥小體的激活[16]。有研究表明，將ATP與LPS聯(lián)合激活NLRP3炎癥小體，可以縮短作用時(shí)間，并且刺激效果更顯著[17]。但文獻(xiàn)中未報(bào)道LPS聯(lián)合ATP激活BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體的具體濃度與反應(yīng)時(shí)間。因此，本研究首先通過實(shí)驗(yàn)確定LPS聯(lián)合ATP激活BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體的最佳模型，結(jié)果表明，先以100 μg/L的LPS作用12 h，然后再以5 mmol/L的ATP繼續(xù)作用45 min，小膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥小體的激活最為顯著，因此選用該濃度和反應(yīng)時(shí)間建立體外小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3激活模型。

CGRP為一種由37個(gè)氨基酸構(gòu)成的多功能神經(jīng)肽，是目前已知最強(qiáng)的擴(kuò)血管物質(zhì)，尤其對腦血管擴(kuò)張具有極強(qiáng)的作用[18]。在免疫炎癥方面，CGRP具有抗炎和促炎雙向調(diào)節(jié)作用。例如，注射CGRP后，煙曲霉感染的真菌性角膜炎小鼠角膜組織中的IL-1β水平明顯降低，角膜炎癥狀隨之減輕，CGRP發(fā)揮了抗炎作用[19];而在偏頭痛模型中，CGRP則通過一系列反應(yīng)參與三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)神經(jīng)源性炎癥從而引發(fā)偏頭痛[20]。為了進(jìn)一步了解CGRP在炎癥中的作用，本研究將不同濃度的CGRP作用于BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果表明CGRP可以顯著抑制NLRP3炎癥小體的激活，但該作用并不呈濃度依賴性。因此我們推測，CGRP發(fā)揮抗炎和促炎的不同作用可能與其組織特性有關(guān)。既往有研究還表明，CGRP具有神經(jīng)保護(hù)作用，該作用可能與CGRP抑制低氧海馬神經(jīng)元c-fos的表達(dá)，降低高閾值鈣電流，抑制低氧時(shí)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流有關(guān)[21]，但其具體機(jī)制尚不很清楚。本團(tuán)隊(duì)在研究CGRP與炎癥關(guān)系時(shí)顯示，CGRP和NLRP3炎癥小體之間存在著千絲萬縷的關(guān)系：CGRP可以抑制IL-1β和抗原呈遞細(xì)胞，而NLRP3炎癥小體的激活則可以促進(jìn)IL-1β的表達(dá)[22];對比CGRP與NLRP3細(xì)胞內(nèi)激活與傳遞途徑顯示，二者存在共同的信號(hào)通路cAMP/PKA[23-24]。因此，我們推測CGRP與NLRP3之間可能存在一定的調(diào)控關(guān)系，故而設(shè)計(jì)了本次實(shí)驗(yàn)。本文結(jié)果表明，CGRP可以降低LPS聯(lián)合ATP誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白含量，減少細(xì)胞中IL-1β的表達(dá)，提示CGRP可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活。本研究揭示了CGRP神經(jīng)保護(hù)的又一作用機(jī)制，為臨床上CGRP治療神經(jīng)炎性疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯馬偉平）