腦蛋白水解物-Ⅰ對PD小鼠的神經保護作用及機制

[摘要]目的研究腦蛋白水解物-Ⅰ（CH-Ⅰ）對帕金森病（PD）小鼠的神經保護作用及其機制。方法成年健康雄性C57BL/6小鼠48只，隨機分為對照組、模型組、CH-Ⅰ 10 mg/kg組和CH-Ⅰ 20 mg/kg組。腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導PD小鼠模型，腹腔注射CH-Ⅰ進行干預治療。通過懸掛實驗評價各組小鼠的神經行為功能，采用Nissl染色觀察紋狀體神經細胞的形態結構，采用免疫印跡法檢測紋狀體神經細胞內酪氨酸羥化酶（TH）、腦源性神經營養因子（BDNF）和神經生長因子（NGF）的表達。結果模型組小鼠的機體協調性較對照組明顯減弱，而CH-Ⅰ 10 mg/kg組和CH-Ⅰ 20 mg/kg組小鼠的機體協調性則較模型組明顯改善（F=5.516，P<0.05）。與模型組相比，CH-Ⅰ 10 mg/kg組和CH-Ⅰ 20 mg/kg組小鼠紋狀體神經細胞NGF、BDNF和TH的表達明顯增加（F=26.567～43.458，P<0.01）。Nissl染色顯示，CH-Ⅰ干預可有效減輕MPTP誘導的細胞損傷。結論CH-Ⅰ可通過調節神經營養因子和TH的表達水平對PD小鼠發揮神經保護作用。

[關鍵詞]蛋白水解產物;腦;帕金森病;二氫吡啶類;神經保護;神經生長因子類;酪氨酸單氧化酶;小鼠

[中圖分類號]R742.5;R338.2[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2022）02-0217-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.046[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20220311.1334.007.html;2022-03-1414：45：20

NEUROPROTECTIVE EFFECT AND MECHANISM OF CEREBROPROTEIN HYDROLYSATE-Ⅰ ON ICE WITH PARKINSON’S DISEASE" WANG Yue， WU Xiaolin， REN Yuqian， MA Xiaoqing， LIU Yingjuan （Institute of Integrative Medicine， Qing-dao University Medical College， Qingdao 266021， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the neuroprotective effect and mechanism of cerebroprotein hydrolysate-Ⅰ （CH-Ⅰ） on mice with Parkinson’s disease （PD）. MethodsA total of 48 healthy adult male C57BL/6 mice were randomly divided into control group， model group， CH-Ⅰ 10 mg/kg group， and CH-Ⅰ 20 mg/kg group. A mouse model of PD was established by intraperitoneal injection of 1-methyl-4-phenyl-1， 2， 3， 6-tetrahydropyridine （MPTP）， and intraperitoneal injection of CH-Ⅰ was given as intervention treatment. The wire hanging test was used to evaluate neurobehavioral function; Nissl staining was used to observe the morphology and structure of neural cells in the corpus striatum; Western blotting was used to measure the expression of tyrosine hydroxylase （TH）， brain-derived neurotrophic factor （BDNF）， and nerve growth factor （NGF） in neural cells of the corpus striatum. ResultsCompared with the control group， the model group had a significant reduction in body coordination， and compared with the model group， the CH-Ⅰ 10 mg/kg group and the CH-Ⅰ 20 mg/kg group had a significant improvement in body coordination （F=5.516，Plt;0.05）. Compared with the model group， the CH-Ⅰ 10 mg/kg group and the CH-Ⅰ 20 mg/kg group had significant increases in the expression of NGF， BDNF， and TH in neural cells of the corpus striatum （F=26.567-43.458，Plt;0.01）. Nissl staining showed that CH-Ⅰ intervention effectively alleviated cell injury induced by MPTP. ConclusionCH-Ⅰ may exert a neuroprotective effect on PD mice by regulating the expression of neurotrophic factors and TH.

[KEY WORDS]protein hydrolysates; brain; Parkinson disease; dihydropyridines; neuroprotection; nerve growth factors; tyrosine 3-monooxygenase; mice

帕金森病（PD）是全球第二大神經退行性疾病，其病理特征是紋狀體中多巴胺含量降低及黑質中多巴胺能神經元變性，以肌強直、震顫、運動遲緩和步態姿勢異常等運動特征為主要臨床表現[1-3]。目前，臨床上PD的治療仍以補充外源性多巴胺類藥物和抑制乙酰膽堿能類藥物為主，但遠期療效不十分理想。腦蛋白水解物-Ⅰ（CH-Ⅰ）是通過動物腦組織蛋白酶水解而獲得的多種氨基酸和低分子肽的混合物，其50%～80%的游離氨基酸可通過血-腦脊液屏障進入腦神經細胞，分子量低于10 000的小分子肽也可透過血-腦脊液屏障并影響呼吸鏈[4]。研究表明，腦蛋白水解物具有抗低氧作用，可改善腦細胞低氧癥狀，增強腦對低氧的耐受性;此外，CH-Ⅰ尚能促進神經細胞的蛋白質合成，使已損傷但未變性的神經細胞恢復功能[5]。SUI等[6]的研究表明，腦蛋白水解物注射液可以通過下調半胱天冬酶分子表達減輕腦缺血再灌注損傷。有文獻報道，CH-Ⅰ對血管性癡呆等神經系統疾病具有較好的療效[7]。但CH-Ⅰ對PD的療效尚未見報道。因此，本研究用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導建立PD小鼠模型，并用CH-Ⅰ進行干預，探討CH-Ⅰ對PD小鼠的神經保護作用及其可能機制。

1材料與方法

1.1實驗材料

CH-Ⅰ注射液（#0190501-1，每支30 mg）為河北智同生物制藥股份有限公司產品;MPTP、甲苯胺藍購自Sigma-Aldrich公司（St. Louis，MO，USA）;單克隆抗體酪氨酸羥化酶（TH，#ab112）、神經生長因子（NGF，#ab52918）、腦源性神經營養因子（BDNF，#ab108319）、GAPDH（#ab8245）購自Abcam公司（Cambridge，USA）。成年健康雄性C57BL/6小鼠48只，8～10周齡，體質量為25～30 g，由南京模式動物研究中心提供。

1.2動物分組及處理

小鼠飼養于溫度（23±2）℃、濕度60%～70%的環境中，給予12 h/12 h晝夜循環光照，可自由進食。小鼠預適應環境7 d后，采用隨機數字法分為對照組（A組）、模型組（B組）、CH-Ⅰ 10 mg/kg組（C組）和CH-Ⅰ 20 mg/kg組（D組），每組12只。除對照組小鼠腹腔注射生理鹽水外，其余3組小鼠每天給予30 mg/kg的MPTP腹腔注射，連續7 d，誘導建立PD小鼠模型。通過爬桿實驗和懸掛實驗判定造模是否成功。然后，CH-Ⅰ 10 mg/kg組以及CH-Ⅰ 20 mg/kg組小鼠連續14 d給予對應劑量的CH-Ⅰ腹腔注射，對照組及模型組小鼠注射等體積生理鹽水。動物的處理遵循青島大學附屬醫院實驗動物倫理委員會制定的實驗動物福利原則。

1.3行為學評價

全部小鼠給藥結束后，進行行為學評價。參考CAO等[8]報道的方法進行懸掛實驗。取一條棉線質長繩，固定在離地面高約50 cm處，被測小鼠倒置懸掛，使小鼠前爪抓住繩子，觀察小鼠的行為：若小鼠用兩后爪抓繩，記為3分;單后爪抓繩，記為2分;后爪不抓繩，記為1分;掉落則記為0分。

1.4免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白表達

行為學實驗結束以后，每組取6只小鼠，應用100 mg/L水合氯醛腹腔注射深度麻醉，于冰上迅速開顱完整取腦，取出紋狀體，置-80 ℃保存。組織稱質量后，按50 mL/g加入裂解液（50 mmol/L Tris、pH值7.4，150 mmol/L NaCl，10 g/L Triton X-100，10 g/L脫氧膽酸鈉，1 g/L SDS，原釩酸鈉，氟化鈉，EDTA以及亮肽素），4 ℃勻漿研磨后，以12 000 r/min離心5 min，收集上清液。采用BCA試劑盒測定蛋白含量。加入上樣緩沖液（主要成分為SDS、DTT、溴酚藍、緩沖鹽溶液等）混勻，于100 ℃水浴中變性5 min，在100～150 g/L SDS-PAGE凝膠中進行垂直電泳，濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上。用50 g/L牛血清清蛋白作為封閉液，孵育2 h。然后加入兔抗TH（1∶1 000）、兔抗NGF（1∶1 000）、兔抗BDNF（1∶1 000）和兔抗GAPDH（1∶5 000）等一抗4 ℃過夜孵育，用TBST洗3次，每次10 min，再加入HRP-IgG二抗（1∶2 000）孵育。ECL顯影，將所有膠片進行掃描，分析各條帶的光密度值。計算其他3組相對于對照組的目的蛋白表達量。

1.5Nissl 染色觀察細胞損傷程度

采用Nissl染色法評估神經元細胞死亡的程度[9-10]。行為學實驗結束后，每組取6只小鼠，用100 g/L水合氯醛腹腔注射深度麻醉，以預冷生理鹽水20 mL灌流后，應用40 g/L多聚甲醛灌注，至小鼠四肢變白、肝臟變硬。隨后取出小鼠整腦，在40 g/L多聚甲醛中固定24 h。常規脫水、透明、浸蠟、包埋，自視交叉后連續冠狀切片，每隔3張抽取1張，貼于經多聚賴氨酸處理的載玻片上。石蠟切片經脫蠟和水化后，加入10 g/L甲苯胺藍溶液，60 ℃孵育40 min。切片用蒸餾水洗滌3次，每次10 min，進行乙醇分級脫水處理后，中性樹脂封片。光學顯微鏡下觀察細胞形態及細胞損傷程度。計算其他3組相對于對照組的染色細胞數。

1.6統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理。計量資料數據以x±s表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA）。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1CH-Ⅰ對PD小鼠行為學障礙的影響

模型組小鼠的機體協調性較對照組明顯減弱，經CH-Ⅰ處理以后，CH-Ⅰ 10 mg/kg組和CH-Ⅰ 20 mg/kg組小鼠的肌肉力量得到恢復，機體協調性較模型組明顯改善（F=5.516，P<0.05）。而CH-Ⅰ 10 mg/kg組和CH-Ⅰ 20 mg/kg組行為學評分比較差異無顯著性（P>0.05）。見表1。

2.2CH-Ⅰ對PD小鼠神經營養因子表達的影響

模型組小鼠紋狀體神經細胞內NGF和BDNF的表達均較對照組明顯降低，經CH-Ⅰ處理后，CH-Ⅰ 10 mg/kg組和CH-Ⅰ 20 mg/kg組小鼠紋狀體神經細胞內NGF和BDNF的表達較模型組明顯增加（F=44.110、26.567，P<0.01）。見圖1和表1。

2.3CH-Ⅰ對PD小鼠TH表達的影響

模型組小鼠紋狀體神經細胞內TH的表達較對照組明顯降低，經CH-Ⅰ處理后，CH-Ⅰ 10 mg/kg組和CH-Ⅰ 20 mg/kg組TH的表達較模型組明顯增加，特別是CH-Ⅰ 20 mg/kg組TH的表達增加尤為明顯（F=43.458，P<0.01）。提示CH-Ⅰ可以通過提高TH的表達而抑制PD進展。見圖2和表1。

2.4CH-Ⅰ對PD小鼠神經細胞損傷程度的影響

紋狀體神經元Nissl染色定量分析顯示，模型組Nissl染色細胞數較對照組明顯減少，經過CH-Ⅰ處理后，CH-Ⅰ 10 mg/kg組和CH-Ⅰ20 mg/kg組Nissl染色細胞數均較模型組明顯增加（F=121.066，P<0.01）。提示MPTP誘導了小鼠的神經元丟失，而CH-Ⅰ可以抑制MPTP誘導的神經元丟失。見圖3和表1。

3討論

PD是一種以紋狀體中多巴胺含量降低及黑質中多巴胺能神經元變性為主要病理特征的神經退行性疾病，多發生于50歲及以上中老年人，給社會和經濟都帶來嚴重影響。PD的發病機制尚不明確，藥物治療是目前臨床治療PD的主要方法，但多為對癥治療及經驗性治療，可延緩病人病情發展、毒副作用少、療效長久的藥物比較缺乏，難以抑制和扭轉病人的神經功能退行性病變。CH-Ⅰ是一種通過酶解動物腦蛋白獲得的低分子肽混合物，對多種神經系統疾病，如卒中、血管性癡呆和急性腦梗死等，均具有顯著的治療效果，但它對PD影響的報道很少。有研究表明，CH-Ⅰ可加速葡萄糖通過血-腦脊液屏障的運轉速度，改善腦能量供應，增加腺苷酸環化酶的活性，催化其他激素系統，改善記憶功能[6，11]。本研究結果顯示，經CH-Ⅰ干預后，MPTP誘導的PD小鼠的機體協調性得到明顯改善，提示CH-Ⅰ可能通過上述機制改善PD小鼠的神經行為功能。

NGF是一種具有神經元營養和促突起生長雙重生物學功能的神經細胞生長調節因子，對中樞及周圍神經元的發育、分化、生長、再生和功能特性的維持均具有重要的調控作用[12]。BDNF是一種在大腦中合成的蛋白質，在中樞神經系統發育過程中對神經元的生存、分化、生長和發育起重要作用[13]。TH是多巴胺合成的限速酶，常被用作檢測多巴胺能神經元完整性的標志酶[14-15]。本研究應用免疫印跡法檢測顯示，CH-Ⅰ可以顯著增加NGF、BDNF以及TH的表達水平，提示CH-Ⅰ可以通過提高PD小鼠神經營養因子和TH的表達而抑制PD的病情進展。

神經元是神經系統的結構和功能單位，尼氏小體（Nissl body）是神經元的特征結構之一，其主要功能是合成神經活動所需要的蛋白質，如細胞某些組件更新和神經遞質相關的蛋白質和酶的生成[11]。本研究Nissl染色結果表明，CH-Ⅰ對MPTP誘導的PD小鼠具有較好的神經保護作用，可以抑制MPTP誘導的神經元丟失。觀察是否具有類似PD癥狀的小鼠行為學實驗，常被用作初步評價PD小鼠病情程度或藥物療效的方法。本研究采用懸掛實驗評估結果也顯示，CH-Ⅰ可以顯著改善PD小鼠的行為障礙。

總之，CH-Ⅰ可以能通過增加NGF、BDNF以及TH的表達水平，抑制MPTP誘導的小鼠神經細胞損傷，從而改善PD小鼠的行為學障礙，發揮神經保護作用。

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（本文編輯馬偉平）