丹參多酚酸鹽對心肌細胞氧化損傷模型大鼠的作用

[摘要]目的探討丹參多酚酸鹽對黃曲霉素B1（AFB1）誘導下大鼠心肌細胞（H9C2細胞）氧化應激損傷的影響。方法用不同濃度的AFB1處理H9C2細胞，通過CCK-8法檢測細胞活力以確定最佳氧化損傷模型AFB1濃度（128 μmol/L）。實驗分為正常對照組（用DMEM培養液培養H9C2細胞）、AFB1誘導模型組（在正常對照組基礎上加入128 μmol/L AFB1）和低、中、高濃度丹參多酚酸鹽干預組（128 μmol/L AFB1+丹參多酚酸鹽濃度分別為5、20、40 mg/L）。采用CCK-8法測定各組細胞的存活率，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態學變化，DCFH-DA染色檢測細胞內活性氧（ROS）水平，Western blot方法檢測氧化應激相關蛋白過氧化物歧化酶2（SOD2）和過氧化氫酶（CAT）蛋白的表達。結果與正常對照組比較，AFB1誘導模型組的細胞形態發生明顯改變，細胞相對存活率降低，細胞內ROS升高，細胞內SOD2、CAT蛋白表達降低;與AFB1誘導模型組相比較，高濃度丹參多酚酸鹽干預組的細胞形態有所改善，細胞相對存活率增加，細胞內ROS明顯降低，SOD2、CAT蛋白表達有所上調，差異均有統計學意義（F=8.023～226.937，Plt;0.05）。結論丹參多酚酸鹽可通過改善抗氧化酶活力、減少ROS的產生、減少氧化應激損傷，改善AFB1誘導的H9C2心肌細胞損傷。

[關鍵詞]丹參多酚酸鹽;黃曲霉素B1;肌細胞，心臟;氧化性應激;活性氧

[中圖分類號]R542.2;R282.71[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2022）02-0189-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.040[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20220311.1334.009.html;2022-03-1413：57：22

EFFECT OF SALVIANOLATE ON MODEL RATS WITH OXIDATIVE DAMAGE OF CARDIOMYOCYTES" GAO Hongrui， YAN Hui， PAN Yang， HAO Yan， LI Jian（Medical Colleage of Qingdao University，" Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo study the effect of salvianolate on oxidative damage of rat cardiomyocytes （H9C2） induced by aflatoxin B1 （AFB1）. MethodsH9C2 cells were treated with different concentrations of AFB1， and the optimal concentration of AFB1 （128 μmol/L） for the oxidative damage model was determined by CCK-8 assay. H9C2 cells were divided into normal group （cultured in DMEM medium）， AFB1-induced model group （cultured in DMEM medium with 128 μmol/L AFB1）， and intervention groups with low， medium， and high concentrations of salvianolate （128 μmol/L AFB1 + 5， 20， and 40 mg/L salvianolate）. Cell survival rate was determined by CCK-8 assay. Morphological changes of cells were observed under an inverted phase contrast microscope. Intracellular reactive oxygen species （ROS） was detected by DCFH-DA staining. Western blot was used to measure the expression levels of stress-related superoxide dismutase 2 （SOD2） and catalase （CAT）. ResultsCompared with the normal group， the AFB1-induced model group showed significantly changed cell morphology， reduced cell survival rate， increased ROS production， and decreased protein expression of SOD2 and CAT. Compared with the AFB1-induced model group， the high-concentration salvianolate intervention group showed improved cell morphology， increased cell survival rate， significantly decreased ROS production， and up-regulated SOD2 and CAT （F=8.023-226.937，Plt;0.05）. ConclusionSalvianolate can ameliorate AFB1-induced H9C2 damage by increasing the activity of antioxidant enzymes and reducing ROS production and related oxidative stress.

[KEY WORDS]salvianolate; aflatoxin B1; myocytes， cardiac; oxidative stress; reactive oxygen species

黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉代謝產生的一類毒素，其中黃曲霉素B1（AFB1）毒性最大、危害最嚴重[1]，可對機體造成嚴重損害，包括致癌、致突變和肝臟損傷等[2]。AFB1的主要靶器官是肝臟[3]，但一些研究表明，AFB1也會導致嚴重的心臟損傷，其機制涉及線粒體損傷、活性氧（ROS）生成和細胞凋亡等[4-5]。丹參是一種傳統的中藥，具有活血化瘀之功效[6]，丹參多酚酸鹽是丹參的水溶性有效活性部分，有很強的抗氧化、抗凋亡、內皮保護和舒張血管等作用[7]，臨床上主要應用于冠心病的治療[8]。有研究表明，急性心肌梗死病人經皮冠狀動脈介入治療圍術期靜脈輸注丹參多酚酸鹽可有效改善氧化應激反應，促進心功能恢復，增加心肌灌注量[9]。但丹參多酚酸鹽對AFB1誘導心肌細胞氧化損傷的影響鮮有報道。本文研究通過AFB1誘導大鼠心肌細胞（H9C2細胞）制備氧化損傷模型，評估丹參多酚酸鹽對H9C2細胞氧化應激損傷的保護作用，為丹參多酚酸鹽的臨床應用提供依據。

1材料和方法

1.1細胞及試劑

H9C2細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司;AFB1（百靈威科技有限公司，純度98%）;丹參多酚酸鹽（上海綠谷制藥有限公司，每瓶100 mg）;DMEM高糖培養液（美國HyClone公司）;胎牛血清（FBS，BI）;二甲基亞砜（DMSO）、5XTris-甘氨酸電泳緩沖液、10×電轉液均購自北京索萊寶公司;CCK-8細胞活力檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒、10×TBST均購自大連美侖生物技術有限公司;過氧化物歧化酶2（SOD2）抗體、過氧化氫酶（CAT）抗體（Anti-Catalase）均購自abcam公司;GAPDH（博奧森生物技術有限公司）;Anti-Rabbit IgG（H+L，Elabscience生物技術有限公司）。

1.2實驗方法

1.2.1H9C2細胞培養H9C2細胞置于含體積分數0.10的FBS和體積分數0.01青鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養液中培養，于含體積分數0.05 CO2、37 ℃培養箱中培養，待細胞生長至80%～90%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后收集細胞，以1∶3比例傳代培養。實驗分為正常對照組（用DMEM培養液培養H9C2細胞）、AFB1誘導模型組（在DMEM培養液中加入濃度128 μmol/L的AFB1）及低、中、高濃度丹參多酚酸鹽干預組（在培養液中加入濃度128 μmol/L的AFB1+濃度分別為5、20、40 mg/L丹參多酚酸鹽）。

1.2.2CCK-8法檢測細胞相對存活率取對數生長期的H9C2細胞，消化、重懸、計數后，將細胞密度調整為5×10⁷/L，接種于96孔板，每孔100 μL，置于恒溫培養箱孵育過夜（15～18 h），分組加藥。①設置正常對照組（H9C2細胞加入DMEM培養液）、DMSO組（DMEM培養液中加濃度2 g/L的DMSO）和AFB1組（AFB1終濃度分別為32、64、96、128、160、192 μmol/L）， 以細胞存活率接近50%為最佳的藥物造模濃度;②設置正常對照組（用DMEM培養液培養H9C2細胞）、不同濃度的丹參多酚酸鹽組（丹參多酚酸鹽濃度分別為5、10、20、40、50、60 mg/L），確定丹參多酚酸鹽的安全使用濃度;③設置正常對照組（用DMEM培養液培養H9C2細胞）和最佳濃度（128 μmol/L）AFB1+丹參多酚酸鹽組（丹參多酚酸鹽濃度分別為0、5、20、40 mg/L）。每組設置6個復孔。培養36 h后，吸除原培養液，然后每孔加入100 μL（含有CCK-8試劑10 μL）的無血清培養液，培養箱孵育1.5 h后，酶標儀檢測450 nm波長處吸光度值，計算細胞相對存活率。細胞相對存活率（%）=（實驗孔吸光度-空白孔吸光度）/（對照孔吸光度-空白孔吸光度）×100%。

1.2.3細胞形態學觀察取對數生長期的H9C2細胞，消化、重懸、計數后，將細胞密度調整為1.5×108/L，接種于6孔板，每孔2 mL。培養24 h后待細胞長到70%～80%融合，吸去細胞上清液，按照“1.2.1”方法分組及處理36 h后，倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態學變化。

1.2.4DCFH-DA染色檢測細胞內ROS水平取對數期生長的H9C2細胞制成細胞懸液，接種至96孔板，每孔5×10³個細胞。孵育24 h后，吸除原培養液，按照 “1.2.1”方法分組并處理，每組設置6個復孔。藥物作用36 h后，吸除原培養液，每孔加入100 μL含有DCFH-DA（10 μmol/L）探針的無血清培養液，37 ℃細胞培養箱內避光孵育30 min。用無血清培養液洗滌細胞3次后，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強度（激發波長為502 nm，發射波長為530 nm），并應用Image J軟件分析各組熒光強度。

1.2.5Western blot方法檢測抗氧化應激相關蛋白表達水平各組細胞干預36 h后，采用RIPA細胞裂解液提取細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣，分別應用體積分數0.10和0.15的SDS-PAGE對蛋白進行分離，之后電轉至PVDF膜上。應用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入1∶2 000的GAPDH、SOD2和CAT一抗，4 ℃孵育過夜，加入相應二抗（抗兔抗體，1∶5 000）37 ℃搖床上孵育1.5 h，通過化學發光成像系統顯影，并用Image J軟件對條帶灰度值進行分析。目標蛋白的相對表達以目標蛋白條帶的灰度值/GAPDH條帶的灰度值表示。

1.3統計學分析

應用SPSS 22軟件進行統計分析。計量資料數據以x±s表示，多組數據比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1最佳藥物造模濃度及丹參多酚酸鹽安全濃度

隨著AFB1濃度的升高，細胞相對存活率呈劑量依賴性下降，差異具有統計學意義（F=293.056，Plt;0.05）;當AFB1的濃度達到128 μmol/L時，H9C2細胞相對存活率為56.83%，符合造模條件。故選擇AFB1濃度128 μmol/L作為造模濃度。與空白對照組相比，0～50 mg/L濃度丹參多酚酸鹽作用于H9C2細胞，細胞相對存活率無明顯變化（Pgt;0.05）;60 mg/L濃度丹參多酚酸鹽作用于H9C2細胞，細胞相對存活率下降（F=2.387，Plt;0.05）。0～50 mg/L濃度的丹參多酚酸鹽為安全使用濃度。

2.2各組 H9C2細胞形態比較

空白對照組H9C2細胞生長狀態良好，細胞呈梭形，緊密連接，邊界清晰可見，貼壁牢固;AFB1誘導模型組H9C2細胞生長密度較低，細胞間空隙增加，可見大片細胞脫落，部分細胞收縮變圓、形狀不規則，可見細胞碎片;不同劑量丹參多酚酸鹽干預組H9C2細胞生長形態及狀態得到一定改善。見圖1。

2.3丹參多酚酸鹽對H9C2細胞損傷的影響

與空白對照組比較，AFB1誘導模型組細胞相對存活率降低;與AFB1誘導模型組相比較，高濃度的丹參多酚酸鹽干預組細胞相對存活率升高，差異有顯著性（F=226.937，Plt;0.05）。見表1。

2.4丹參多酚酸鹽對心肌細胞ROS水平影響

熒光顯微鏡下各組H9C2細胞內ROS觀察結果見圖2。與正常對照組相比，AFB1誘導模型組細胞內ROS水平升高;與AFB1誘導模型組相比，高濃度丹參多酚酸鹽干預組ROS水平顯著降低，差異有顯著性（F=62.751，Plt;0.05）。見表1。

2.5各組抗氧化蛋白SOD2和CAT表達比較

與正常對照組比較，AFB1誘導模型組心肌細胞SOD2、CAT蛋白表達降低;與AFB1誘導模型組相比，高濃度丹參多酚酸鹽干預組SOD2、CAT蛋白表達增加，差異有顯著意義（F=12.090、8.023，Plt;0.05）。見表1。

3討論

AFB1是毒性最強、最常見的黃曲霉毒素，被歸類為第一類致癌物。既往研究表明，AFB1誘導毒性的原因之一是氧化應激，氧化應激導致抗氧化酶活力降低及ROS過量生成，從而誘導心肌細胞的損傷[10]。也有研究表明，AFB1誘導心肌細胞線粒體損傷從而促進心肌細胞凋亡[4-5]。丹參多酚酸鹽具有較強的抗氧化活性，體內外研究結果顯示，其可通過降低ROS水平，穩定細胞線粒體膜電位，改善與恢復細胞功能活性[11]。有研究表明，丹參多酚酸鹽可抑制H₂O₂處理的大鼠心肌細胞ROS的過量生成[11]，可通過抑制氧化損傷來防治H₂O₂所致的大鼠心肌細胞重構[12]。本研究以128 μmol/L濃度的AFB1作用大鼠H9C2細胞制備心肌細胞損傷模型，結果顯示，與正常對照組相比，AFB1誘導模型組心肌細胞形態發生明顯改變，細胞相對存活率顯著降低，提示AFB1對心肌細胞有明顯的毒性作用;與AFB1誘導模型組相比，應用高濃度丹參多酚酸鹽（40 mg/L）干預H9C2細胞36 h，細胞形態及數量有所改善，細胞相對存活率增加，說明高濃度的丹參多酚酸鹽對心肌細胞有保護作用。

ROS是一種氧化能力較強的自由基，包括超氧離子（O^-₂）、羥基自由基（-OH）、過氧化氫（H₂O₂）和單線態氧（O₂）等。正常情況下，細胞內的各種抗氧化劑和抗氧化酶如谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、SOD、CAT等可使體內ROS的生成和消除處于平衡狀態;在病理條件下，ROS產生過多會打破氧化系統/抗氧化系統的平衡，進而導致機體處于氧化應激狀態。其中SOD是人體內天然的抗氧化酶，可催化超氧化物自由基生成氧或H₂O₂，然后通過GPX和CAT催化反應將H₂O₂分解為水和氧，有效清除多余ROS，維持體內自由基的動態平衡，其活性高低間接反映機體清除氧自由基的能力。本文實驗結果顯示，與正常對照組相比，AFB1誘導模型組ROS升高，SOD2、CAT蛋白表達降低，提示AFB1處理心肌細胞后，破壞了氧化/抗氧化的平衡機制，導致細胞內自由基的異常累積;與AFB1誘導模型組比較，高濃度的丹參多酚酸鹽干預組心肌細胞ROS降低，SOD2、CAT蛋白表達增加，表明丹參多酚酸鹽可能通過減少過量的ROS產生、改善抗氧化酶活力、降低氧化應激損傷來抑制AFB1誘導的心肌細胞損傷。

綜上所述，丹參多酚酸鹽對AFB1損傷的心肌細胞有一定的保護作用，其作用機制可能與改善SOD2、CAT等抗氧化酶活力，進而促進過量ROS的清除，減輕氧化應激損傷有關。本研究可為臨床防治心臟損傷相關疾病提供新思路。

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（本文編輯黃建鄉）