基于近紅外光譜反射技術(shù)的碭山酥梨花粉活力快速檢測

徐葉挺，張校立，莊紅梅，董文軒，龔 鵬

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所/農(nóng)業(yè)部新疆地區(qū)果樹科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，烏魯木齊 830091；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，沈陽 110866)

0 引 言

【研究意義】花粉是有花植物雄蕊中的雄性生殖細(xì)胞，高等植物的雄配子體[1]?；ǚ凼歉叩戎参锏男叟渥芋w，在育種上可用來解決不同果樹品種開花期不遇和異地果樹品種雜交困難問題。人工輔助授粉或雜交授粉，需要早期采集和貯存花粉，尤其是雜交育種[4]，花粉生活力是花粉具有存活、生長、萌發(fā)或發(fā)育的能力[5]。【前人研究進(jìn)展】檢測花粉活力的方法有染色法、萌發(fā)法、授粉結(jié)實(shí)檢測法及其他一些方法，常用的染色法有聯(lián)苯胺染色法[6]、TTC染色法[7]、I2-KI染色法[8]、FCR染色法[9]等，萌發(fā)法又包括離體萌發(fā)法[10]和活體萌發(fā)法[11]。目前這些花粉活力的測定方法中，染色法測定值不是偏高就是偏低[6]。離體萌發(fā)法測定值準(zhǔn)確可靠，但步驟多影響因素多難掌握[11]?；铙w萌發(fā)測定法，僅適合于感受性柱頭，測定值偏低，柱頭表面性質(zhì)對所測試樣也有所限制[11]。花粉授粉結(jié)實(shí)檢測法，時間周期長，費(fèi)時費(fèi)力，且花粉粒較小，人工授粉時不能定量只能定性[12]。近紅外檢測技術(shù)是一種具有方便、快速、高效、準(zhǔn)確、不破壞樣品、不消耗化學(xué)試劑、不污染環(huán)境的檢測技術(shù)。近紅外光譜法(NIRS)利用有機(jī)物中含有C-H、O-H、N-H 和S-H等化學(xué)鍵的合頻或倍頻振動，以漫反射方式獲得在近紅外區(qū)的吸收光譜，通過主要成分分析、偏最小二乘法等現(xiàn)代化學(xué)計(jì)量學(xué)的手段，建立物質(zhì)光譜與待測成分含量間的多元線性回歸方程，實(shí)現(xiàn)利用近紅外光譜信息對待測成分含量的快速預(yù)測。近紅外光譜用于煙草[13-14]、茶葉的分類[15]與咖啡堿[16]，光導(dǎo)纖維探頭的出現(xiàn)，近紅外檢測技術(shù)可直接用于糧食或水果傳送帶上進(jìn)行產(chǎn)品分揀[17-20]。近紅外檢測技術(shù)不僅作為常規(guī)方法用于食品的品質(zhì)分析[21, 22]，而且已用于食品加工過程中組成變化的監(jiān)控和動力學(xué)行為的研究[23]，如近紅外光譜技術(shù)在水產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用[24]；通過測定顏色變化來確定農(nóng)產(chǎn)品的新鮮度、成熟度，了解食品的安全性[25, 26]；檢測蘋果、葡萄、梨果汁加工過程中可溶性和總固形物的含量變化[26-28]；通過可見-近紅外光譜技術(shù)(LS-SVM)判定蜂花粉的貯存時間[29]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前雖然我國近紅外檢測技術(shù)的研究在某些方面較多，但在花粉活力上檢測還未應(yīng)用。亟需基于近紅外光譜反射技術(shù)的碭山酥梨花粉活力快速檢測研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用近紅外檢檢測方法對碭山酥梨花粉活力進(jìn)行檢測，得到快速檢測花粉活力的方法，分析研究基于近紅外光譜反射法快速檢測碭山酥梨花粉活力的可行性，為工業(yè)化生產(chǎn)花粉提供快速檢測依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

以2017年3月安徽碭山縣果紅豐花粉有限公司當(dāng)年生產(chǎn)碭山酥梨花粉(花粉生產(chǎn)提純后即干燥低溫-20℃下貯藏，花粉活力下降速度較緩)為研究對象。將200 g花粉混合后封裝在20個紙質(zhì)包裝中，放在4℃下貯藏(花粉活力下降速度相對較快)。以花粉從-20℃轉(zhuǎn)入-4℃儲藏的日期為活力下降的起點(diǎn)，即6月7日(0 d)、6月14日(7 d)、7月4日(27 d)、7月20日(43 d)與8月11日(65 d)。將20個花粉樣品取出室溫蘇醒6 h后，進(jìn)行近紅外光譜掃描及花粉活力測定。測定完成后繼續(xù)放入4℃下貯藏。

1.2 方 法

1.2.1 近紅外光譜掃描

用丹麥FOSS公司生產(chǎn)的NIRSystems Lab 5000型近紅外分析儀進(jìn)行樣品的光譜采集。具體方法參照徐葉挺[30]利用近紅外光譜采集花粉光譜方法。

1.2.2 花粉活力

參照徐葉挺[30]測定扁桃花粉活力方法。

不同活力花粉中含H鍵有機(jī)物含量變化是影響光譜變化的主要原因。采用多元線性回歸、主成分回歸和偏最小二乘法等定量校正方法來建立不同花粉活力的定性定量模型。在建立光譜模型時，采用全局中心馬氏距離(globalhood，GH)和“T”檢驗(yàn)進(jìn)行兩輪異常值的剔除，其中中心馬氏距離GH≥10剔除光譜異常值，T檢驗(yàn)>2.5剔除化學(xué)異常值。經(jīng)過對的100個不同活力花粉光譜圖異常值剔除后，剩余99個光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定標(biāo)模型的建立。

近紅外定標(biāo)模型優(yōu)劣的參數(shù)：決定系數(shù)(R2)、定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)差(SCE)、交互驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差(SECV)、交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(1-VR)等。使用不同光譜預(yù)處理方法可得到不同的近紅外模型，以最高的交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(1-VR)和最低的交互驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差(SECV)為標(biāo)準(zhǔn)，來確定并選擇最佳定標(biāo)模型。并利用AACC39-00對近紅外預(yù)測模型進(jìn)行判定，即驗(yàn)證相對分析誤差RPDCV(RPDCV=SD/SECV)。當(dāng)驗(yàn)證相對分析誤差RPDCV≥3.0，則定標(biāo)方程預(yù)測效果極準(zhǔn)確；當(dāng)RPDCV≥2.5時，該定標(biāo)方程可用于日常分析檢測。當(dāng)RPDCV在2.0～2.5，則預(yù)測方程可接受，但預(yù)測準(zhǔn)確度不佳。當(dāng)在2.0以下，方程預(yù)測準(zhǔn)確度較差。

以花粉活力與波段光譜反射率的相關(guān)性分析結(jié)果為依據(jù)，選取相關(guān)性最強(qiáng)的3個波段進(jìn)行組合，即R1540+R1956、R1540+R2438、R1956+R2438、R1540+R1956+R2438等4種方式，將不同花粉活力對應(yīng)的反射率進(jìn)行算術(shù)相加、算術(shù)相加后取對數(shù)、各自取對數(shù)后相加3種數(shù)學(xué)處理，所得的數(shù)據(jù)作為自變量，以花粉活力為因變量，建立Asymptotic1、SRichards1、ExpAssoc模型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Statistica5.0對梨花粉不同時間測定的活力值進(jìn)行方差分析。通過WinISIⅢ近紅外定標(biāo)軟件，利用花粉活力值及近紅外光譜圖進(jìn)行定標(biāo)模型的建立，根據(jù)定標(biāo)模型參數(shù)判斷該模型的準(zhǔn)確度。不同花粉活力與光譜反射率的相關(guān)性分析、作圖與模型擬合采用Origin2016完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 碭山酥梨花粉活力定標(biāo)集的活力差異

研究表明，在4℃貯藏下，隨著貯藏期的延長，花粉活力呈下降趨勢。梨花粉在以6月7日為起點(diǎn)(0 d、20份測定值)、6月14日(7 d、20份測定值)、7月4日(27 d、20份測定值)、7月20日(43 d、20份測定值)與8月11日(65 d、20份測定值)。其平均花粉活力分別為70.6%、60.3%、57.1%、53.2%與34.1%，標(biāo)準(zhǔn)差分別為±3.89%、±4.24%、±6.43%、±6.99%與±8.40%。從開始貯藏活力的70.6%降到34.1%，與開始儲藏時相比活力下降了52%，且不同貯藏時間下的花粉活力相互差異均顯著。100份梨花粉活力測定值定標(biāo)集。圖1

注：不同字母表示LSD測驗(yàn)下在P<0.05水平下差異顯著

2.2 碭山酥梨花粉活力近紅外光譜預(yù)處理

研究表明，不同花粉活力的近紅外光譜圖在光譜形狀也存在差異，有Y軸漂移較大，吸收峰疊加嚴(yán)重現(xiàn)象。光譜吸收峰得到增強(qiáng)，光譜差異更加顯著，校正了Y軸基線漂移現(xiàn)象。經(jīng)導(dǎo)數(shù)處理與去散射方法結(jié)合處理光譜后，消除了光譜去散射的影響，使不同花粉活力的光譜平行移動得到改善。近紅外光譜是由分子振動從基態(tài)向高能級躍遷時產(chǎn)生的，主要反映的是含氫基團(tuán)X-H(如C-H、O-H、N-H、S-H等)振動合頻的和倍頻吸收。近紅外光譜的合頻吸收位于2 000～2 500 nm，一級倍頻位于1 400～1 800 nm，二級倍頻位于900～1 200 nm，三級和四級或更高級倍頻則位于700～900 nm。在1 410～1 450 nm處C-H(CH3、CH2)是組合頻2ν+δ，1 920～1 980 nm處C=O、3ν倍頻，1 940～1 960 nm處游離的-OH組合頻ν+2δ和3δ，C-H、CH3、CH2組合頻ν+δ。圖2

注：SNVD既標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量校正結(jié)合去除趨勢，圖2-a花粉近紅外反射原始光譜圖；2-b 導(dǎo)數(shù)處理1，4，4，1結(jié)合SNVD下的光譜圖

2.3 碭山酥梨花粉活力近紅外定標(biāo)模型的建立與驗(yàn)證

研究表明，近紅外預(yù)測模型較優(yōu)，其交互驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差SECV值為2.630，交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)1-VR值為0.953，RPDCV值為4.632>3.0，定標(biāo)預(yù)測效果驗(yàn)證準(zhǔn)確，可進(jìn)行日常檢測分析。表1

表1 不同光譜預(yù)處理下的梨花粉活力定標(biāo)模型參數(shù)

2.4 碭山酥梨花粉活力與不同波段光譜反射率的相關(guān)性

研究表明，梨花粉活力與其光譜反射率在近紅外光波段均呈正相關(guān)性，在1 950～1 960 nm下相關(guān)性為0.813，1 520～1 566 nm下相關(guān)性為0.790～0.793，2 432～2 444 nm下相關(guān)性為0.768。在多個不同的波段都有相關(guān)性均大于0.6，即不同波長下對應(yīng)的含氫集團(tuán)發(fā)生了變化，這些變化與花粉活力發(fā)生變化呈相關(guān)。花粉活力改變的實(shí)質(zhì)是花粉本身發(fā)生了特定的生理生化的變化，這些變化對應(yīng)的含氫集團(tuán)發(fā)生變化，被近紅外光譜儀捕捉后反映在不同波長下的反射率中。圖3

圖3 不同波長下近紅外光譜反射率與花粉活力的相關(guān)性

2.5 碭山酥梨梨花粉活力的估算模型

研究表明，擬合后R2均能達(dá)到0.946 8以上，其中以算術(shù)相加后取對數(shù)作為lg(R1540+R1956)自變量，ExpAssoc模型擬合度達(dá)0.999 8，擬合效果較好。表2

表2 梨不同花粉活力與光譜變量的函數(shù)關(guān)系

3 討 論

花粉在貯藏期間持續(xù)不斷進(jìn)行呼吸等新陳代謝活動，同時消耗有機(jī)酸和可溶性糖等營養(yǎng)物質(zhì)，花粉中所含有的蛋白質(zhì)、酶、核酸及其它的物質(zhì)在儲藏的過程中極易變性，導(dǎo)致花粉的生活力下降直至喪失[1]?；ǚ刍盍梢酝ㄟ^花粉中過氧化物酶的活性，呼吸代謝中的還原酶，花粉粒內(nèi)的淀粉著色，花粉體內(nèi)的酯酶作用能產(chǎn)生熒光的極性物質(zhì)熒光素，脫氫酶的活性，花粉管長度來判斷花粉的生活力。這些方法是利用花粉體內(nèi)的酶，或者代謝物質(zhì)，或者是花粉本身所含有的基礎(chǔ)物質(zhì)[9]。利用花粉呼吸作用或者電導(dǎo)率測定[6]，依據(jù)胞質(zhì)是否具有酶活性進(jìn)行的染色測定[7]，花粉離體萌發(fā)測定[10]，形成有效種子能力的測定。這些花粉活力測定的實(shí)質(zhì)可能是花粉在呼吸作用或者其它的生命活動中，進(jìn)行能量的傳遞與轉(zhuǎn)化，其保持活力的物質(zhì)在低溫下可以緩慢的降解或者轉(zhuǎn)化。生命勢能在貯藏時間的加長而出現(xiàn)損耗。作為一個帶有遺傳物質(zhì)的單元，自我啟動的能力降低以至于不能萌發(fā)而死亡。通過研究利用近紅外測定花粉活力，對花粉代謝作用進(jìn)行全方位的掃描測定，所得的結(jié)果比起花粉活力單一途徑及過程中物質(zhì)測定的準(zhǔn)確率高。從開始貯藏活力蛋白質(zhì)的42.21 mg/g增加到44.64 mg/g，蛋白質(zhì)增加2.43 mg/g，增加5.8%?；ǚ刍盍εc脂肪r為0.623，花粉活力與硫甙r為0.813；花粉活力與含水量r為-0.886，花粉活力與蛋白質(zhì)r為-0.807。碭山梨花粉活力與脂肪、硫甙、含水量與蛋白質(zhì)之間均有相互關(guān)系。

物質(zhì)的近紅外光譜由物質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)決定。其組成和結(jié)構(gòu)與近紅外光譜之間有一定的函數(shù)關(guān)系[20]?，F(xiàn)在，近紅外光譜技術(shù)(NIRS)已經(jīng)在食品、藥品、化學(xué)品等多個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[24]。近紅外檢測技術(shù)在動植物內(nèi)含物上的應(yīng)用。煙葉中27種包括鈣、鎂元素化學(xué)成分[14]。卷煙中的焦油、煙堿和一氧化碳釋放量[13]。紫花苜蓿的粗蛋白和粗纖維。奶牛精料補(bǔ)充料中的化學(xué)成分及可消化總養(yǎng)分[22]。山藥中多糖。高粱中的總酚、縮合類單寧以及3-脫氧花青素含量。葡萄糊狀物中麥角固醇含量。果蔬基質(zhì)中果膠的甲酯化程度[25]。大豆樣品水分、灰分、蛋白質(zhì)以及脂肪含量[21]。研究對花粉活力的近紅外測定其實(shí)質(zhì)也是對花粉活力的組成與結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析得到定量的結(jié)果。其花粉活力定標(biāo)模型相關(guān)系數(shù)R2為0.985，交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)1-VR為0.952 9，其活力測定的交互驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差SECV為2.5%。利用近紅外反射技術(shù)快速測定花粉活力可行。

碭山梨花粉顆粒的個頭均較小，通常一個梨花粉有43.61～47.85 μm。在使用離體萌發(fā)法時，在顯微鏡下觀察到的花粉只是花粉群體當(dāng)中的一小部分。進(jìn)行顯微鏡下觀察花粉活力時，由于不同花粉活力在蛋白、脂肪、硫甙等內(nèi)含營養(yǎng)物質(zhì)含量不相同[30]，需要多次重復(fù)的均值才能表示花粉活力的生理現(xiàn)象[30]。對于研究中每個貯藏時間后的花粉活力，均是由多個數(shù)據(jù)的平均來代表。由于實(shí)驗(yàn)中使用的近紅外光譜儀是樣品杯是圓形的，充填著大量的花粉粒。近紅外光譜掃出不同花粉活力時的近紅外譜線，掃描近紅外譜線代表的是這次花粉的整體活力。研究使用的花粉活力的均值代表不同貯藏時間的花粉活力。擬合的碭山梨花粉活力與近紅外光譜有函數(shù)關(guān)系，方程R2為0.985，1-VR為0.952 9，其活力測定誤差SECV為±2.5%。

4 結(jié) 論

4.1采用近紅外光譜快速預(yù)測碭山酥梨花粉活力，其定標(biāo)模型相關(guān)系數(shù)R2為0.985，交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)1-VR為0.952 9，其活力測定的交互驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差SECV為2.5%。利用近紅外反射技術(shù)快速測定花粉活力可行。

4.2碭山酥梨花粉活力與其光譜反射率在近紅外光波段均呈正相關(guān)性，在1 950～1 960 nm下相關(guān)性為0.813，1 520～1 566 nm下相關(guān)性為0.790～0.793，2 432～2 444 nm下相關(guān)性為0.768。通過3種數(shù)學(xué)處理后的變量擬合的Asymptotic1、SRichards1、ExpAssoc模型，擬合后R2均能達(dá)到0.946 8以上，其中以算術(shù)相加后取對數(shù)作為lg(R1540+R1956)自變量，ExpAssoc模型擬合度達(dá)0.999 8。3個波段組合的4種方式以SRichards1模型擬合效果均較好，擬合方程的R2均大于0.992 1。