蘋果樹腐爛病病原種類及其親緣關系分析

李亞鵬，張王斌,2，儀子博

(1塔里木大學植物科學學院，新疆阿拉爾 843300；2塔里木大學南疆農業有害生物綜合治理重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】我國蘋果樹的栽植面積、總產量均位于世界第一[1]。新疆獨特的氣候光熱資源和區域比較優勢，為阿克蘇地區發展優勢特色林果業提供得天獨厚的自然條件[2-3]，阿克蘇地區蘋果果面光滑細膩、色澤光亮、皮薄、肉質脆、口感風味極佳。阿克蘇地區的蘋果種植業屬于典型的沙漠綠洲農業，不僅具有極高的經濟價值，而且還起著防風固沙的作用[4]。蘋果樹腐爛病(Valsamali)是蘋果樹上一種具有毀滅性的病害。蘋果樹腐爛病在國內已有記錄[5-7]，2008新疆生產建設兵團第四師蘋果樹腐爛病大爆發，果樹死亡率達40%；2013～2014年阿克蘇地區10年樹齡的蘋果樹上腐爛病平均發生率為30%，發病嚴重的果園發病率高達80%[8]。蘋果樹腐爛病主要危害蘋果樹的枝干，可使蘋果樹樹皮腐爛壞死，刮開發病部位為褐色，當側枝上的樹皮壞死1周時會導致營養輸送終止，使病部以上部分不能結果，導致產量降低。當主干發病嚴重時，會嚴重影響樹體運輸營養物質，導致樹勢衰弱，最終導致樹體死亡，阿克蘇地區的蘋果樹腐爛病發生日益嚴重，研究蘋果樹腐爛病菌的種類及其親緣關系，對有效防治蘋果樹腐爛病有重要意義[9-10]。【前人研究進展】蘋果樹腐爛病主要由殼囊孢屬真菌引起，殼囊孢屬(Cytospora)屬于子囊菌門(Asco-mycota)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、間座殼目(Diaporthales)、黑腐皮殼科(Valsaceae)。將病原菌命名為ValsamaliMiyabeet[11]。臧睿和桂騰茸等[12-13]的研究已明確我國的蘋果樹腐爛病菌是由V.maliMiyabeetYamada、V.malicolaZ.Urb、V.persoonii(=Leucostompersoonii)和V.ceratosperma4個種類組成。其中V.mali種下又可以劃分為Valsamalivar.Mali(Vmm)和Valsamalivar.Pyri(Vmp)2個不同的變種，并明確Vmm為我國蘋果樹腐爛病中最主要的致病菌；杜琴等[14]的研究鑒定出新疆林木腐爛病菌主要為V.malicola、V.sordida、V.ceratosperma；劉應敏等[15]已對新疆蘋果樹腐爛病菌的Cytosporaschulzeri(有性型V.malicola)進行具體研究。【本研究切入點】目前相關研究多集中于如何提高果品果質及經濟效益，且該地區的蘋果樹腐爛病菌種類還尚未明確。需研究蘋果樹腐爛病菌的種類及其親緣關系。【擬解決的關鍵問題】以阿克蘇地區不同區域蘋果樹腐爛病病樣為材料，采用常規組織分離法和枝條燙傷接種法分離和鑒定菌株，記錄形態學特征和發病情況，研究阿克蘇地區蘋果樹腐爛病病菌種類、培養形狀、致病性等，為病害的診斷及抗病品種篩選提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 發病枝條與樹皮

隨機采集從阿克蘇地區紅旗坡農場(N41°15′23″E 81°17′54″)和新疆生產建設兵團農一師5團7連(N41°22′26″E 80°45′19″)蘋果園6份發病枝條和樹皮(含有健康組織)，放置于牛皮紙袋備用。表1

表1 樣品采集信息

培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基[16](PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂條20 g、蒸餾水1 000 mL；馬鈴薯葡萄糖水培養液(PD培養液)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水 1 000 mL。

接種枝條：從塔里木大學校園內采集1～2年生健康蘋果樹枝條。

1.1.2 儀器

中科美菱超低溫冷凍儲存箱、SW-CJ-2FD超凈工作臺、DHG-9240(A)數顯鼓風干燥箱、THZ-C氣浴恒溫振蕩器、MLS-3750桌上型蒸汽滅菌鍋、GXZ-436B智能光照恒溫培養箱、AL204電子分析天平、D8023CTL-K4微波爐、Power Basic基礎型電泳儀電源、Chemi Dos XRS熒光和化學放光成像分析系統、nexus GSX1基因擴增儀、Mastercycler pros梯度PCR儀C1000、HH-S4數顯恒溫水浴鍋、ML203電子天平、Heraeus Pico21小型離心機、Multifuge XIR高速冷凍離心機。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌分離、培養及保存

病原菌分離采用常規組織分離法[15]，用無菌手術刀片在枝條及樹皮刮取5×5(mm)含有典型腐爛病病征的組織塊，然后用75%的乙醇消毒30s，0.1%升汞消毒30s，無菌水反復浸洗3次，將組織塊置于無菌濾紙晾干后移至準備好的PDA平板上(每個平板放3～5塊組織塊)。于25℃恒溫光暗交替培養3 d，待長出菌落后，純培養，獲得純化菌株。接種于PDA斜面試管中，置于4℃冰箱保存備用。

1.2.2 培養性狀觀察

將接種純化菌株的PDA平板置于25℃培養箱中暗培養。從第2 d開始每天定點觀察菌落的顏色、形狀、菌絲生長量、及菌絲氣生情況，記錄產孢體的形成時間、大小、數目及分布，采用十字交叉法測量菌落生長速度。

1.2.3 致病性測定

參考臧睿等[17]的接種方法加以改動。在塔里木大學校園內選取1～2年生健康的蘋果枝條，截成15～20 cm的小段，自來水沖洗干凈后用75%的乙醇浸泡10 min，用無菌水沖洗。將枝條表皮用燒熱的打孔器(直徑5 mm)間隔一定距離燙傷。從已在PDA平板上生長3 d的各分離株菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，將帶有菌絲的一面貼在燙傷處并將枝條放置在裝有少量無菌水的錐形瓶中。每個錐形瓶中3根枝條，每根枝條上2個接種點，每個菌株3個重復，以無菌PDA餅作為對照。將錐形瓶置25℃恒溫培養箱中光暗交替培養，于第5、10和15 d觀察記錄發病情況，采用十字交叉法測量病斑擴展速度。

1.2.4 菌株DNA提取

1.2.4.1 藥品及試劑

(1)PD培養液：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，制作方法同PDA培養基，高壓滅菌后室溫保存。

(2)0.5 mol/L EDTA(乙二胺四乙酸，pH 8.0)：將18.61 g Na2EDTA·2H2O溶于70 mL ddH2O，滴加10 mol/L NaOH溶液調節pH值至8.0，用ddH2O定容至100 mL，高壓滅菌后室溫保存。

(3)2.0 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)：將24.20 g Trisbase溶于80 L ddH2O，滴加濃鹽酸調節pH值至8.0，用ddH2O定容至100 mL，高壓滅菌后室溫保存。

(4)2%(w/v)CTAB提取緩沖液(十六烷基三甲基溴化銨)：將2 g CTAB溶于50 mL ddH2O，分別加入5 mL 2.0 mol/L Tris-HCl、4 mL 0.5 mol/L EDTA、28 mL 5.0 mol/L NaCl溶液，然后定容至100 mL，封裝后高壓滅菌。

(5)TE緩沖液(pH 8.0)：0.5 mL 2.0 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.2 mL 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)，定容至100 mL，封裝后高壓滅菌。

(6)1.4 mol/L NaAc(醋酸鈉)：將11.48 g NaAc溶解于80 mL ddH2O，然后定容至100 mL，封裝后高壓滅菌。

(7)5.0 mol/L NaCl溶液：將29.22 g NaCl溶于90 mL ddH2O，全部溶解后定容至100 mL。

(8)苯酚：氯仿：異戊醇(V/V/V=25∶24∶1)溶液：將50 mL苯酚、48 mL氯仿、2 mL異戊醇相溶，棕色玻璃瓶避光保存。

(9)氯仿：異戊醇(V/V=24∶1)溶液：將96 mL氯仿、4 mL異戊醇相溶，棕色玻璃瓶避光保存。

1.2.4.2 菌絲提取

將分離的菌株接種在PDA平板上，在25℃光照培養箱內培養3 d后，用直徑5 mm的打孔器打取菌餅轉接到含有100 mL PD培養液的錐形瓶中，置于25℃恒溫搖床160 r/min震蕩培養5 d。之后用4層滅菌紗布過濾菌絲體，再用無菌水沖洗3遍，用滅菌的吸水紙吸出多余水分，并用烘干箱烘干，將烘干的菌絲轉移到離心管，置于-80℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2.4.3 菌株基因組DNA提取

參考唐俊煜等[18]采用改良的CTAB法提取腐爛病菌株基因組總DNA。將CTAB緩沖液放置于65℃水浴鍋預熱1 h，將異戊醇和NaAc置于-20℃的冰箱內預冷。將菌絲體放入研缽中，加入液氮將菌絲體快速研磨成粉，轉移至離心管內。將預熱完成的CTAB緩沖液加入到離心管中并充分震蕩搖勻，置于65℃水浴40～60 min，期間輕搖3～4次；加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇(25∶24∶1)，震蕩搖勻10 min，4℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液；加入等量氯仿：異戊醇(24∶1)，震蕩搖勻10 min，4℃、13 000 r/min離心5 min，取上清液；加入1/10體積的1.4 mol/L NaAc和等體積的異丙醇，將離心管置于-20℃冰箱中沉淀2 h；沉淀完成后4℃、13 000 r/min離心5 min，取沉淀，用75%的乙醇洗滌2～3次，加入適量的TE緩沖液溶解沉淀。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后置于-20℃冰箱保存備用。

1.2.4.4 基因片段的PCR擴增

選取β-tubulin和EF-1α2個基因片段進行PCR擴增，β-tubulin基因的擴增選用通用引物Bt2a(5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′)和Bt2b(5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′)，EF-1α基因的擴增選用引物EF1-728F(5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′)和EF-986R(5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′)。2種基因片段的PCR反應體系和擴增程序參照唐俊煜[18]的方法進行：β-tubulin 基因PCR擴增程序為：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸1 min，共38個循環，72℃延伸10 min,終止反應;EF-1α基因PCR擴增程序為：94℃預變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸30 s，共40個循環，72℃延伸10 min，終止反應。將擴增出的PCR產物送至上海生工科技股份有限公司測序。

1.3 數據處理

獲得β-tubulin和EF-1α序列后，在GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網站上BLAST進行同源性對比及分析，并下載同源序列。利用MEGA7.0軟件，采用鄰接法[19](Neighbor-Joining，NJ)建立系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 PDA培養3 d菌落形態差異

研究表明，從病樣的典型病斑處經過分離、純化出11個真菌菌株。根據培養3 d時的菌落顏色可分為淡黃色和乳白色兩類菌株，其中淡黃色菌株有7個，分別為：HQP2-1、HQP2-2、HQP2-3、HQP2-4、YLC3-1、YLC3-2，占63.64%；乳白色菌株有4個，分別為：HQP3-1、YLC1-1、YLC1-2、YLC2-1，占36.36%。圖1

圖1 PDA培養3 d時的菌落形態

2.2 兩類菌株培養性狀比較

2.2.1 培養性狀

研究表明，15 d時的菌落顏色主要以黃褐色為主；各菌落平均生長速度為20 mm/d，且2 d時的菌落直徑存在一定的差異淡黃色菌落平均生長速率高于乳白色菌株；淡黃色菌落為放射狀，乳白色菌落為羽毛狀，且均未產生氣生菌絲。在阿克蘇地區以無氣生菌絲的蘋果樹腐爛病菌為主要種。表2

表2 兩類菌株培養性狀

2.2.2 致病性關系比較

研究表明，分離出的11株菌株均可使健康蘋果枝條發病，在接種3 d后開始出現明顯的水漬狀病斑，發病部位皺縮且內陷，與健康部位交界處有明顯的界限。在接種15 d后病斑蔓延至整根枝條，表皮下的組織全部呈褐色，且有酒糟味。乳白色菌株接種的枝條上出現明顯的黑色點狀物，淡黃色菌株接種的枝條均未產生黑色點狀物，2種類型的菌株致病性存在一定的差異。從各個發病枝條上再分離得到與原來相同的菌株。其中只有2株產生黑色點狀物，占18.18%，說明不產生黑色點狀物的菌株為優勢種。圖2

圖2 致病性

2.3 菌株的分子生物學鑒定

2.3.1 β-tubulin序列

研究表明，HQP2-1、HQP2-2、HQP2-3、HQP2-4和V.ceratosperma(KC840674.1)及其無性型C.sacculus(KP195740.1、KP195741.1)聚為一枝，相似度為100%，以上4個菌株均為V.ceratosperma親緣關系很近的生理小種。YLC3-1，YLC1-1、YLC1-2和YLC2-1分別與登錄號為KT934370.1、KT934367.1的V.mali聚為一枝，相似度分別為93%和87%，這4個菌株均為與V.mali具有一定遺傳分化的小種。圖3

圖3 β-tubulin序列構建的系統發育樹(NJ)

2.3.2 EF-1α序列

研究表明，HQP3-1，YLC1-1、YLC1-2、YLC3-1、YLC3-2，HQP2-1、HQP2-2、HQP2-3、HQP2-4與V.mali及其無性型C.mali不同登錄號聚為一枝，相似度分別為100%、99%、95%，以上9個菌株均為與V.mali親緣關系較近或具有一定遺傳分化的小種。圖4

圖4 EF-1α序列構建的系統發育樹(NJ)

2.3.3 病原鑒定結果

研究表明，共鑒定出10個菌株，4個乳白色菌株和2個淡黃色菌株鑒定結果為V.mali，占60%，說明V.mali在PDA上的培養性狀具有不同類型，且以乳白色類型為主；其余4個淡黃色菌株鑒定結果為V.ceratosperma，占40%。表3

表3 蘋果樹腐爛病菌鑒定

3 討 論

根據菌株類型及在PDA上培養性狀發現，研究與郭開發[20]對V.mali和V.ceratosperma的研究結果一致，但是殼囊孢屬Cytospora種類較多，分布范圍廣，種間的形態特征和培養性狀具有很高的相似性，僅依靠傳統形態學準確鑒定十分困難。因此，研究結合β-tubulin、EF-1α序列分析對病原菌進行鑒定。但2種分析方法在結果上也存在一定的差異，僅通過β-tubulin或EF-1α一種序列分析無法鑒定病原菌到具體的種類，每種序列片段分析存在一定的局限性，在研究系統發育時需要采用多基因序列分析法，才能使結果的準確性得到提高。

鑒定得各菌株為V.mali或V.ceratosperma，且V.mali為天山南簏蘋果樹腐爛病主要致病種，這與臧睿[17]和桂騰茸[13]等的研究結果一致。杜琴[14]和郭開發[20]均在新疆蘋果樹上分離得到V.malicola，且劉應敏等[15]證實V.malicola的無性型C.schulzeri可使新疆蘋果樹發病。研究并未分離出V.malicola，其余結果與杜琴及郭開發等研究結果一致。V.malicola在杜琴和郭開發分離出的菌株中占比未達1%，該菌在新疆的分布少，由于采集地點不同和研究樣品數量較少導致研究未能分離得V.malicola。

4 結 論

淡黃色菌株為V.mali或V.ceratosperma，乳白色菌株為V.mali。故天山南簏蘋果樹腐爛病菌為黑腐皮殼屬V.mali(無性型C.mali)和V.ceratosperma(無性型C.sacculus)，其中V.mali為天山南簏的主要致病種，在PDA上存在不同類型的培養性狀。