電子垃圾拆解區兒童尿液中6-羥基硫酸褪黑素水平的檢測分析

羅 瓊，霍 霞，陳梓涵，楊江夏，黃 宇，徐錫金，3

（1．汕頭大學醫學院環境醫學與發育毒理學實驗室，廣東 汕頭 515041；2．暨南大學環境學院，廣東 廣州 510632；3．汕頭大學醫學院細胞生物學與遺傳學教研室，廣東 汕頭 515041）

褪黑激素是由松果體合成并有晝夜節律性分泌的一種具有調節生物節律、促進睡眠、調節免疫活性、調節能量代謝和抗腫瘤能力的神經內分泌激素。褪黑激素由色氨酸轉化為5-羥色胺后，在5-羥色胺-N-乙酰轉移酶和羥基吲哚-O-甲基轉移酶的催化作用下合成[1-2]，經肝細胞色素P450酶的作用轉化為6-羥基褪黑素，再與硫酸鹽結合形成6-羥基硫酸褪黑素（6-sulfatoxymelatonin，aMT6s），其中70%～80%的aMT6s隨尿液排出體外。晨尿中aMT6s濃度反映了夜間褪黑激素的最高水平[3]。研究表明，錳、鐵、銅等金屬在機體的累積會損傷神經系統，通過使神經元鈣離子穩態失調、DNA修復受損和線粒體功能障礙等機制增加神經退行性疾病的發病風險[4]。同時，重金屬可干擾多巴胺代謝、皮質醇釋放等過程，從而擾亂機體的內分泌系統[5]；此外，重金素暴露亦可引起免疫細胞及炎癥標志物水平的改變，對免疫系統產生消極的影響[6]。兒童作為環境污染的易感人群，且身體的各個系統正處于逐步發育完善階段，比成年人更容易受到鉛等重金屬污染物的毒性影響[7]。因此，本研究通過分析電子垃圾拆解區兒童尿液中aMT6s和外周血血清中白介素-13的水平，探討環境污染物暴露對兒童神經內分泌免疫調節功能的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2016年11—12月，共招募213名3～7歲兒童，平均年齡為（4.57±0.86）歲，其中暴露組105名（男56名，女49名）來自汕頭市潮陽區貴嶼鎮（電子垃圾拆解區），參照組108名（男60名，女48名）來自汕頭市濠江區（非電子垃圾拆解區）。所有參與兒童均未補充褪黑激素，無激素類藥物應用史及慢性病史。本研究經汕頭大學醫學院倫理委員會審查通過，所有參與研究的兒童家長均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

人 ProcartaPlex Human Cytokines Panel（34plex）試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）；人尿液aMT6s競爭酶免疫試劑盒（德國IBL international公司）；Luminex 200多功能流式點陣儀（美國Luminex公司）；Infinite M200 Pro光柵型全波長酶標儀（瑞士Tecan公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集收集兒童晨尿（中段尿）15 mL，1 mL分裝后置-20℃冰箱保存。采集兒童早晨空腹肘靜脈血2 mL于真空無抗凝劑采血管中，置于冰盒中運送至實驗室，3 000 r/min離心15 min后分離血清，200 μL分裝后置-80℃冰箱保存。

1.3.2 尿液aMT6s檢測取尿樣于冰上解凍，1 500 r/min離心5 min，取10 μL上清液加500 μL分析緩沖液稀釋，渦旋混勻；取10 μL標準品、質控品分別加500 μL分析緩沖液稀釋，渦旋混勻；分別取標準品、質控品和樣本各50 μL加入96孔微量滴定板；每孔中分別加入50 μL酶結合物和褪黑素硫酸鹽抗血清；振蕩器上500 r/min避光孵育2 h；緩沖液清洗4次；分別加入100 μL TMB底物液；500 r/min振蕩器上避光繼續孵育30 min；加入100 μL TMB終止液，搖勻；450 nm波長檢測。并將所測得的aMT6s濃度值（單位為nmol/L）除以同一標本的尿肌酐濃度值（單位為mmol/L）來表示aMT6s的水平。

1.3.3 外周血血清白介素-13檢測將兒童外周血血清樣本送至杭州聯科生物技術有限公司進行檢測，采用ProcartaPlex Human Cytokines Panel（34plex）試劑盒對兒童外周血血清白介素-13水平進行分析，在Luminex 200多功能流式點陣儀上進行檢測。

1.4 統計學方法

使用SPSS 23.0統計軟件進行分析。非正態分布的計量數據以M(Q1，Q3)表示，用Mann-WhitneyU檢驗進行組間比較；正態分布的計量數據以±s表示，用獨立樣本t檢驗進行組間比較。采用Spearman相關分析判斷兒童尿液aMT6s水平與血清白介素-13水平的關系。當P＜0.05時認為差異具有統計學意義。采用GraphPad Prism 9軟件作圖。

2 結果

2.1 兩組兒童尿液aMT6s水平的分布特征及比較

兩組兒童尿液中aMT6s水平為非正態分布，暴露組兒童aMT6s水平為59.30（37.81，94.04)，參照組兒童aMT6s水平為32.63（15.97，60.38），暴露組兒童aMT6s水平顯著高于參照組（P＜0.01）；暴露組男童和女童aMT6s水平均高于參照組，差異具有統計學意義（P值均＜0.05），見圖1。

圖1 參照組和暴露組兒童尿液中aMT6s水平的比較

2.2 兩組兒童外周血血清白介素-13水平的比較

兩組兒童血清白介素-13水平為正態分布，暴露組兒童血清白介素-13水平為（6.88±5.41）pg/mL，參照組兒童血清白介素-13水平為（3.61±1.58）pg/mL，暴露組高于參照組，差異具有統計學意義（P＜0.01）。

2.3 兒童尿液aMT6s與外周血血清白介素-13水平的關系

Spearman相關分析結果表明，兒童尿液aMT6s水平與血清白介素-13水平呈正相關關系（r=0.326，P＜0.001）。

3 討論

褪黑激素除了具有調節生物節律、促進睡眠功能外，還參與調節免疫反應，調節促炎和抗炎細胞因子的水平，如白介素-1β、腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ和白介素-10等[8]，并影響Th1/Th2細胞向Th1方向極化[9-10]。臨床研究顯示，膿毒癥患者的尿aMT6s排泄量顯著高于健康成人，并且白介素-6、腫瘤壞死因子-α與aMT6s水平呈顯著正相關關系。提示在膿毒癥期間，免疫活性細胞可能通過產生更多的褪黑激素對機體產生保護作用[11]。另一項關于哮喘兒童的研究發現aMT6s水平升高與丙二醛、8-羥基-2′-脫氧鳥苷水平升高顯著相關，同時aMT6s水平升高與肺部彈性及肺部炎癥改善相關[12]。以上研究提示褪黑激素水平的改變與機體免疫功能及炎癥狀態有關，而尿aMT6s含量的檢測可反映疾病或環境污染物對機體內源性褪黑激素分泌狀態的影響。

本研究顯示暴露組兒童尿液中aMT6s和血清白介素-13水平顯著高于參照組，這說明貴嶼鎮不規范的電子垃圾拆解方式所導致的環境污染物暴露可能會誘導內源性褪黑激素和炎癥因子白介素-13水平發生變化。動物實驗研究發現鉛的毒性會損傷5-羥色胺能和多巴胺能系統并導致紋狀體、大腦皮層、背側海馬等部位中5-羥色胺或其代謝產物的增加[13]，提示重金屬暴露可能會影響內源性褪黑激素的水平。與文獻[11-12]的研究結果相似，環境污染物暴露可能會誘導暴露組兒童體內產生更多的褪黑激素，從而進行自我保護。我們前期針對同一人群的研究發現，貴嶼鎮（暴露組）兒童體內血鉛水平均顯著高于濠江區（參照組），且暴露組兒童體內去甲腎上腺素濃度及脂蛋白相關磷脂酶A2、白介素-6等炎性介質的水平均發生了改變；表明重金屬污染物暴露影響兒童神經內分泌的免疫調節功能[14-15]，但其中的機制仍需要進一步研究。尿液aMT6s與外周血血清白介素-13水平的正相關關系則提示神經內分泌和免疫系統之間存在著明顯的關聯，機體可以通過分泌褪黑激素對免疫系統進行調節[16]。提示褪黑激素可能在環境污染物暴露對機體神經內分泌免疫系統的不良影響中起著重要的作用。

綜上所述，本研究表明電子垃圾拆解區環境污染物暴露對兒童神經內分泌免疫調節功能產生一定的影響，為進一步研究其發生機制提供了理論依據。