鯉低氧適應性狀的全基因組關聯分析*

吳碧銀 許 建 曹頂臣 徐 鵬 張瀚元 朱優秀1, 江炎亮 趙紫霞

鯉低氧適應性狀的全基因組關聯分析*

吳碧銀1,2#許 建2#曹頂臣3徐 鵬4張瀚元2朱優秀1,2江炎亮2趙紫霞2①

(1. 上海海洋大學 水產科學國家級實驗教學示范中心 上海 201306；2. 中國水產科學研究院 農業農村部水生動物基因組學重點實驗室 北京 100141；3. 中國水產科學研究院黑龍江水產研究所 黑龍江 哈爾濱 150070；4. 廈門大學海洋與地球學院 福建省海洋生物資源開發利用協同創新中心 福建 廈門 361102)

低氧適應是水產養殖物種的重要性狀，篩選用于改良低氧適應性狀的分子標記及候選基因有助于魚類耐低氧品種選育。在數量性狀和質量性狀的遺傳研究中，全基因組關聯分析(GWAS)廣泛應用于性狀相關標記和基因的發掘。本研究對鯉()養殖群體開展了低氧脅迫實驗，選取了低氧敏感和低氧耐受的極端性狀個體作為研究對象，應用鯉魚250K高通量分型芯片進行單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點分型，經過數據質控后獲得90個樣本的87222個多態性位點的分型結果。通過GWAS，篩選到4個低氧適應性狀關聯的位點：carp229220、carp195901、carp001519和carp063890，在關聯位點附近注釋到等23個可能與低氧適應性狀關聯的候選基因；此外，還篩選到7個潛在關聯的SNP位點。本研究初步獲得了鯉低氧適應性狀相關聯的基因組區間，為后續效應基因精細定位奠定了基礎。

鯉；低氧適應；單核苷酸多態性分型芯片；全基因組關聯分析

鯉()是馴化歷史較為悠久的物種，出土的新石器時代早期魚骨比較分析顯示，我國鯉魚養殖歷史可追溯到距今8000年以前(Nakajima, 2019)。如今，鯉已成為世界性的養殖品種，養殖地域遍布歐亞大陸，年產量達418.95萬t (FAO, 2020)，為保障人類糧食安全和營養安全發揮了重要作用。在水生環境中，氧飽和濃度僅為同體積空氣中的1/30，且擴散速度緩慢，空間分布不均勻，為適應聚集性養殖條件下的氧供應不足，低氧成為魚類馴化過程中的高強度選擇壓力之一，如何從遺傳角度解析鯉低氧適應馴化的機制，對于基礎研究和育種應用都有重要的意義。

近年來，研究者對多種魚類開展了低氧適應性狀相關研究，從表觀遺傳、基因表達差異等角度揭示了魚類在低氧脅迫下的不同應答模式，以及低氧對魚類生長、發育、繁殖、免疫等生理過程的影響(肖武漢, 2014; Abdel-Tawwab, 2019)。多種不同成因和程度的低氧均可導致攝食下降、生長停滯和疾病易感(Fitzgibbon, 2007; Portner, 2010; Abdel-Tawwab, 2014; Araújo-Luna, 2018)。以海洋青鳉()為對象的研究顯示，低氧通過甲基化調控造成跨世代的生殖損傷，即使子代及其生殖細胞從未暴露于低氧環境下，也會因親代的低氧暴露史而出現性腺發育遲緩(Wang, 2016; Lai, 2019)。在低氧脅迫下，魚類鰓絲原有的規則形態發生改變，板層排列紊亂和扭曲，細胞異常增生和壞死并存，同時，伴隨著滲透壓調節的紊亂，離子平衡和酸堿平衡均被打破，進而導致一系列血液生化指標的波動(Cadiz, 2017; Araújo-Luna, 2018; Abdel- Tawwab, 2019)。大量轉錄組研究(Zhang, 2017; Qi, 2018; Ding, 2020;Qi, 2020)表明，低氧誘導因子(hypoxia inducible factor,)通路是最主要的低氧應答信號通路，典型的差異表達基因還包括促紅細胞生成素(erythropoietin,)，血紅素加氧酶(heme oxygenase,)屬于負責氧分子轉運的珠蛋白家族，參與糖酵解/糖異生、乳酸代謝、丙酮酸代謝、三羧酸循環以及活性氧(reactive oxygen species, ROS)清除等。

本研究聚焦于解析鯉低氧適應性狀馴化的遺傳機制，應用鯉250K高通量SNP芯片(Xu J, 2014; Xu P, 2014)，對鯉養殖群體低氧適應性狀開展GWAS分析，定位性狀關聯位點及其效應基因，旨在為培育魚類耐低氧品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

松荷鯉()實驗群體來源于中國水產科學研究院黑龍江水產研究所呼蘭試驗場。實驗個體同批孵化、同池飼養至3月齡[平均體重(107±20) g，平均體長(16.5±2.3) cm]，移入室內暫養缸中，25℃暫養7 d使之適應環境。暫養期間，氣泵充氧，控制溶解氧濃度>6.0 mg/L，每天早、中、晚各投餌1次。

1.2 低氧脅迫實驗

暫養結束后，選取體質健康、體重相近、無外傷、無感染、能夠正常游泳和攝食的個體用于低氧脅迫實驗。實驗魚分5組，分別置于500 L的塑料缸中，每組260尾個體。實驗開始前使用氣泵充氧，控制溶解氧濃度>6.0 mg/L，禁食24 h后停止充氧，使溶解氧濃度持續自然下降。使用ORION STAR A223型溶解氧測量儀(Thermo Scientific, 美國)，每隔15 min記錄溶解氧濃度值，實驗開始3 h后，溶解氧濃度降至0.43mg/L，個體陸續缺氧昏迷，按昏迷順序對實驗個體進行編號，移出實驗缸。實驗開始5 h后，溶解氧濃度穩定在0.27 mg/L，將剩余個體移入50 L封閉玻璃缸，通過調節水量控制溶解氧濃度繼續緩慢下降。實驗開始10 h后，實驗魚全部昏迷，溶解氧濃度降至0.12 mg/L。

1.3 樣本采集與處理

實驗魚按缺氧昏迷順序編號，記錄個體信息并采集靜脈血樣本，剔除出現外傷或感染的個體，共采集到1243尾有效個體樣本。使用動物基因組DNA提取試劑盒(天根DP324-03，中國)，提取100尾極端性狀個體的血液DNA。其中，每組最早昏迷的10尾個體歸為低氧敏感組，5組共計50尾；最晚昏迷的10尾個體歸為低氧耐受組，5組共計50尾。

1.4 基因分型和數據質控

挑選電泳條帶清晰無拖尾、260 nm/280 nm在1.8～2.0之間、濃度大于100 ng/μL的高質量DNA樣本用于SNP分型，滿足要求的樣本共91個，包括低氧敏感樣本43個，低氧耐受樣本48個。使用鯉250K高通量SNP芯片(賽默飛世爾Axiom? carp genotyping array, 美國)進行分型檢測，分型實驗由紐勤生物科技(上海)有限公司完成，使用Affymetrix Power Tools和SNPolisher軟件讀取分型數據。分型數據質控標準設置為探針質量≥0.85，SNP分型成功率≥95%，樣本分型成功率≥90%，最小等位基因頻率≥5%。

1.5 全基因組關聯分析

使用PLINK軟件進行鯉低氧適應性狀GWAS分析，使用“--logistic”和“--adjust”參數，顯著性關聯位點標準為FDR校正后的<0.05，提示性關聯位點標準為0.05≤FDR校正后<0.1。對相關SNP位點的50 kb側翼區域進行基因注釋。使用R語言的CMplot軟件包繪制曼哈頓圖和Q-Q圖。

2 結果

2.1 SNP分型

應用鯉魚250K高通量分型芯片進行SNP分型，分型及質控結果見表1?；蚍中徒Y果顯示，91個樣本中共獲得199577個SNPs原始分型數據，通過質控的樣本共90個，包括低氧耐受樣本48個，低氧敏感樣本42個。質控后得到90個樣本的87222個SNPs位點的分型數據進行后續GWAS分析。

表1 基因分型和數據質控結果

Tab.1 Genotyping and data quality control

2.2 全基因組關聯分析

考慮到群體分層因素對GWAS的影響，首先對低氧敏感和耐受樣本進行主成分分析(圖1)，可以看出，實驗樣本中不存在顯著的群體分層，群體分層對本研究的影響很小，并在后續關聯分析中引入了主成分分析結果進行校正。通過PLINK進行GWAS分析，關聯分析結果見表2和表3，包括4個關聯位點(carp229220、carp195901、carp001519和carp063890)和7個提示性關聯位點(carp000442、carp088568、carp195897、carp188137、carp110811、carp001038和carp051623)。使用R語言的CMplot軟件包生成鯉低氧適應性狀GWAS分析的Q-Q圖和曼哈頓圖(圖2和圖3)，比較Q-Q圖觀測值和期望值的一致性，散點分布與趨勢線吻合度較高，可以推測關聯分析結果較可靠。從圖3可以看出，4個顯著性關聯位點與7個提示性關聯位點成簇分布，大部分位于41號染色體上，表明該基因組區域可能存在與低氧適應性狀密切關聯的基因。

圖1 鯉實驗群體主成分分析

2.3 低氧適應性狀關聯基因注釋

為了定位低氧適應性狀相關的基因，針對篩選的4個顯著關聯的SNP位點carp229220、carp195901、carp001519和carp063890，在每個SNP位點的50 kb上下游區域進行基因注釋，篩選出23個候選基因(、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、和)。

3 討論

本研究應用鯉250K高通量SNP芯片對鯉養殖群體低氧適應性狀開展GWAS分析，篩查低氧適應性狀的顯著性關聯SNP位點，定位低氧適應性狀的關聯基因。該芯片是本課題組于2014年開發完成的，是鯉的第一個高通量基因分型平臺。經過鯉的多個品系的評估，25萬個SNP位點中有近3/4 (199577個)被證明在鯉中是多態性的。此外，鯉SNP芯片還在近緣物種中進行了驗證，獲得了2萬～5萬個多態性位點。該SNP芯片對鯉及其近緣物種的性狀解析和多態性評估等研究具有重要價值(Xu J, 2014)。

圖2 鯉低氧適應性狀GWAS關聯分析的Q-Q圖和密度圖

Fig.2 Q-Q plot and SNP-density plot of genome-wide association of hypoxia adaptation trait of common carp

圖3 鯉低氧適應性狀GWAS關聯分析的曼哈頓圖

在GWAS分析中，如果樣本中存在不同的群體分層結構，會對關聯分析的結果產生顯著影響，造成基因組膨脹系數(genomic inflation factor, GIF)的增加和假陽性的出現。主成分分析可以通過對群體的基因分型結果降維，提取主要的幾個主成分，并直觀地觀察到群體內部的分層現象。本研究中主成分分析結果顯示，群體分層對關聯分析結果影響很小。使用PLINK軟件進行GWAS分析時，由于本研究的低氧適應性狀為二項式性狀(敏感和耐受)，所以，采用邏輯(logistic)回歸分析，并將主成分分析的結果(前5個主成分)作為輔因子，進行結果的校正。對于GWAS分析后原始值的分布，通過繪制Q-Q圖分析值的觀測值和期望值的一致性，如果偏離趨勢線太多，則提示可能有群體分層等因素影響分析的準確性，本研究的Q-Q圖提示研究的可靠性較高，SNP密度圖也顯示分析用的8萬多個位點較均勻地分布在50個染色體上。

在自然群體數量性狀GWAS的研究報道中，通常會篩選到幾十個到數百個關聯位點，而本研究只定位到4個SNP位點，這與所采用的實驗群體有關。實驗用魚為松荷鯉養殖群體，這一品種是利用多元雜交選育技術培育的鯉魚品種，選育親本來源包括鏡鯉()、荷包紅鯉()和黑龍江野鯉()，主要選育目標為抗寒和生長(石連玉等, 2012)。由于其親本品種間存在低氧適應性狀的明顯差異，特別是歷經長期高強度馴化的鏡鯉為低氧耐受品種，而荷包紅鯉為地方原種，低氧耐受能力相對較弱(趙紫霞等, 2014)，在新品種松荷鯉個體間存在低氧適應性狀的顯著差異，其遺傳基礎為來源于鏡鯉基因組的少量低氧適應馴化位點。

通過全基因組關聯分析篩查到的4個顯著性關聯位點中，carp229220和carp001519為同義突變，carp195901為非編碼區突變，carp063890位于一個抗原提呈相關轉運蛋白Tapasin編碼序列內，可能并非真正的效應位點。目前，在顯著性關聯位點附近注釋到23個功能基因，腫瘤壞死因子受體相關因子(TNF receptor associated factors,)編碼一類具有胞內信號轉導功能的蛋白，它們介導了多種生物學功能，包括先天性和獲得性免疫應答、胚胎發育、應激反應和骨代謝(胡宸曦, 2020)。腫瘤壞死因子受體相關因子4 (TNF receptor associated factor 4,)是家族中比較特殊的一員，生物學功能多且復雜，參與調控nuclear factor kappa B (NF-κB)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)和絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPK)等低氧相關信號通路(王沂等, 2015)。韓雪晴等(2019)通過亞細胞定位和雙熒光素酶報告基因研究發現，在293T細胞中主要定位于細胞質，可增強NF-κB活性。過氧化物氧化還原酶(peroxiredoxin,)基因家族編碼具有過氧化氫酶活性的抗氧化蛋白，在生物體中參與多個與活性氧相關的信號通路，參與氧活性物質清除和細胞保護(丁婷婷等, 2020)。朱珍珍(2017)利用CRISPR/Cas9技術對斑馬魚()家族進行敲除，分別獲得、和缺陷突變體，使用15 mmol/L的H2O2處理發現，斑馬魚缺陷的胚胎耐受脅迫能力降低。此外，脂肪醛脫氫酶(fatty aldehyde dehydrogenase,)基因產物參與無氧代謝，候選基因中還包含多個具體功能未知的信號轉導分子(如、和)和轉錄調控因子(如、和)，均與低氧應答或低氧損傷修復相關，可能貢獻于低氧適應表型。此外，除了carp063890位于scaffold1133，未能裝配至特定染色體，其余3個位點均定位于41號染色體，表明該染色體區域存在與低氧適應性狀密切關聯的基因。

本研究初步篩選了低氧適應性狀的關聯位點，注釋了這些位點附近可能參與低氧適應調控通路的基因，為下一步開展區域內效應基因精細定位、基因表達和功能分析等研究奠定了基礎，后續將通過低氧轉錄組分析、QTL定位等手段，篩查導致性狀差異的效應基因及基因型，開展深入功能分析，為探索鯉低氧適應性狀的分子機理和魚類耐低氧品種選育提供借鑒。

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Genome-Wide Association Analysis of Hypoxia Adaptation Traits in Common Carp ()

WU Biyin1,2#, XU Jian2#, CAO Dingchen3, XU Peng4, ZHANG Hanyuan2, ZHU Youxiu1,2, JIANG Yanliang2, ZHAO Zixia2①

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Key Laboratory of Aquatic Genomics, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Chinese Academy of Fishery Sciences, Beijing 100141, China; 3. Heilongjiang River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Harbin, Heilongjiang 150070, China; 4. College of Ocean and Earth Sciences, Xiamen University, Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources, Xiamen, Fujian 361102, China)

To reveal the genetic mechanism underlying hypoxia adaptation, it is important to identify the molecular markers and candidate genes associated with hypoxia adaptation traits. Genome-wide association studies (GWSA) are frequently used in the genetic dissection of both quantitative traits and qualitative traits, while a large number of molecular markers and samples are needed. In this study, the GWSA of the hypoxia adaptation traits of common carp () was conducted. A total of 1243 samples were collected for the hypoxia stress experiment, and individuals with extreme traits in the hypoxia experiment were selected as the preliminary screening samples. The Carp 250 K single nucleotide polymorphism (SNP) array was used for genotyping, generating genotypes of 199577 SNPs for 91 samples. After quality control with a genotyping call rate of over 95% and a sample call rate of 90%, a total of 87222 SNPs and 90 samples were obtained for the association analysis. A principal component analysis (PCA) showed no population stratification in the samples from both the sensitive and tolerant groups. Taking the PCA results as a covariance, a logistic regression was used for the association test with a threshold of the false discovery rate value of 0.05. Four associated SNPs for hypoxia adaptation traits (carp229220, carp195901, carp001519, and carp063890) were identified, and 23 genes were found in the neighboring regions of the four SNPs, including TNF receptor-associated factor 4 (), fatty aldehyde dehydrogenase (), peroxiredoxin 5 (), estrogen-related receptor gamma (), guanine nucleotide-binding protein subunit gamma-3 (), G-protein coupled receptor 12 (), general transcription factor 3C polypeptide 4 (), transcription factor SOX-30 (), and transcription elongation (). Additionally, seven SNPs passed the suggestive line, which could be validated in future research with larger samples. Putative genomic regions related to hypoxia adaptation for domesticated common carp were obtained in this study, which shed new light on the fine mapping and identification of causative genes and the underlying mechanisms of hypoxia adaptation.

Common carp; Hypoxia adaptation; SNP array; Genome-wide association study

ZHAO Zixia, E-mail: zhaozx@cafs.ac.cn

S917.4

A

2095-9869(2022)02-0098-09

10.19663/j.issn2095-9869.20201218002

* 國家重點研發計劃(2018YFD0900102)和中國水產科學研究院基本科研業務費(2020TD24; 2015C007)共同資助 [This work was supported by the National Key Research and Development Program (2018YFD0900102), and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2020TD24; 2015C007)].

#共同第一作者：吳碧銀，E-mail: wuby1619@126.com；許 建，E-mail: xuj@cafs.ac.cn

趙紫霞，副研究員，E-mail: zhaozx@cafs.ac.cn

2020-12-18,

2021-01-25

吳碧銀, 許建, 曹頂臣, 徐鵬, 張瀚元, 朱優秀, 江炎亮, 趙紫霞. 鯉低氧適應性狀的全基因組關聯分析. 漁業科學進展, 2022, 43(2): 98–106

WU B Y, XU J, CAO D C, XU P, ZHANG H Y, ZHU Y X, JIANG Y L, ZHAO Z X. Genome-wide association analysis of hypoxia adaptation traits in common carp (). Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(2): 98–106

(編輯 馮小花)