PPP3CA?PLCB1和STK3 基因在小尾寒羊性腺軸組織中的表達量研究

周祖陽 劉玉芳 儲明星

摘要 為揭示候選基因 PPP3CA、PLCB1和STK3在 綿羊多羔中的作用，以不同產羔數小尾寒羊為研究對象，采用實時熒光定量PCR技術檢測 PPP3CA、PLCB1、STK3基因在小尾寒羊大腦、小腦、下丘腦、垂體、卵巢、子宮和輸卵管中的表達情況。結果表明：PPP3CA基 因在小尾寒羊卵巢內的相對表達量高于其他組織，其在 FecB? BB型小尾寒羊下丘腦中的相對表達量顯著高于++型（ P< 0.05），其在 FecB? BB型小尾寒羊輸卵管中的相對表達量極顯著高于++型（ P< 0.01）; PLCB1基因在FecB? BB型小尾寒羊小腦中的相對表達量最高， FecB? BB型小尾寒羊垂體和卵巢組織中的相對表達量顯著高于++型（ P< 0.05）; STK3 基因在++型小尾寒羊大腦中的相對表達量高于其他組織，其在 FecB? BB型小尾寒羊卵巢中的相對表達量極顯著高于++型（ P< 0.01）。該研究結果表明 PPP3CA、PLCB1、STK3基因可 作為潛在候選基因，參與小尾寒羊多羔性狀的調控，且具有一定的正向調節(jié)作用。

關鍵詞 綿羊;多羔;組織表達; PPP3CA;PLCB1;STK3

中圖分類號 S 813? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）06-0074-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.06.016

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on the Expression Quantity of PPP3CA，PLCB1 and STK3 Genes in Gonadal Axis Tissues of Small Tail Han Sheep

ZHOU Zu-yang1，2，LIU Yu-fang1，2，CHU Ming-xing1 （1.Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction of Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Institute of Animal Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193;2.College of Life Science and Food Engineering，Hebei University of Engineering，Handan，Hebei 056001）

Abstract In order to reveal the role of candidate genes? PPP3CA，PLCB1，STK3? in multi-lamb sheep，Small Tail Han Sheep with different litter size were used as the research objects in this experiment.Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of? PPP3CA，PLCB1? and? STK3? genes in brain，cerebellum，hypothalamus，pituitary gland，ovaries，uterus and oviduct of Small Tail Han Sheep.The results showed that the relative expression quantity of? PPP3CA? gene in the ovaries of Small Tail Han Sheep was higher than that in other tissues，，while its relative expression quantity in the hypothalamus of? FecB? BB type Small Tail Han Sheep was significantly higher than that in ++ type （ P< 0.05）.The relative expression quantity in the oviduct in BB type was extremely significantly higher than that in ++ type （ P< 0.01）.The relative expression quantity of? PLCB1? gene in the cerebellum of? FecB? BB type Small Tail Han Sheep was the highest，its relative expression quantity in the pituitary and ovarian tissues of BB type Small Tail Han Sheep was significantly higher than that in ++ type Small Tail Han Sheep （ P< 0.05）.The relative expression quantity of? STK3? gene in the brain of ++ type Small Tail Han Sheep was higher than that in other tissues，and its relative expression quantity in the ovary of BB type Small Tail Han Sheep was extremely significantly higher than that in ++ type Small Tail Han Sheep （ P< 0.01）.The research results showed that? PPP3CA，PLCB1? and? STK3? genes could be used as potential candidate genes and involved in the regulation of prolificacy traits in Small Tail Han Sheep，and they had positive regulatory effects.

Key words Sheep;Multi-lamb;Tissue expression; PPP3CA;PLCB1;STK3

基金項目 國家自然科學基金項目（31772580）;國家肉羊產業(yè)技術體系專項（CARS-38）;中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程項目（CAAS-ZDRW202106，ASTIP-IAS13）;河北省自然科學基金青年項目（C2019402261）。

作者簡介 周祖陽（1994—），男，湖北鄂州人，碩士研究生，研究方向：動物遺傳育種研究。*通信作者，研究員，博士，從事肉羊遺傳育種研究。

收稿日期 2021-05-24;修回日期 2021-06-03

綿羊肉質細嫩，蛋白質含量高，膽固醇含量低，富含人體必需的各種氨基酸、維生素、 礦物質元素等，深受消費者的喜愛[1]。綿羊繁殖力受多種因素的調控，包括遺傳背景、飼養(yǎng)條件、 營養(yǎng)水平等，其中排卵數能直接影響母羊的產羔數[2]，而排卵數和產羔數是衡量繁殖力的2個重要指標[3]。因此，研究影響綿羊排卵和產羔性狀的相關候選基因有助于透析綿羊多羔性狀的分子機理，為提高綿羊繁殖力提供一定的理論參考。

鈣調磷酸酶是一種鈣依賴的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，它廣泛參與了調節(jié)機體的多種生理功能[4]。PPP3CA是鈣調磷酸酶催化亞基A（calcineurin A，CNA）的一種亞型，在動物發(fā)育過程中至關重要[5]。目前針對 PPP3CA 基因的相關研究大多集中在肌肉組織和骨骼肌上，研究發(fā)現(xiàn) PPP3CA 基因在調控骨骼肌纖維中起關鍵作用，其在不同肌肉組織中均有表達[6]，且能抑制成纖維細胞生長因子23 （FGF23） 的表達，與胰島素樣生長因子1（ IGF1） 共同參與骨骼肌生長發(fā)育的調節(jié)[7-8]。 PPP3CA 基因與繁殖相關的研究報道較少。Dias等[9]研究發(fā)現(xiàn) PPP3CA 基因對性早熟有顯著影響。另有研究發(fā)現(xiàn)， PPP3CA對雌 激素信號轉導和卵母細胞減數分裂也具有重要作用[10]。此外，在精原干細胞減數分裂和精子發(fā)生過程中， PPP3CA具 有去磷酸化作用[11]。同時， PPP3CA也 參與了動物胎盤內皮細胞功能的調節(jié)[12]。下丘腦-垂體-性腺軸（HPGA）的激活主要依賴于神經細胞內促性腺激素釋放激素（GnRH）的分泌[13]。KISS1/GPR54信號通路是目前已知的GnRH分泌最重要的通路。以往的研究大多集中于 KISS1、GPR54這兩個基因多態(tài)性的變化，但有研究發(fā)現(xiàn)KISS1、GPR54的信號 需要通過下游關鍵基因磷脂酶CB1（PLCB1）介導才能傳遞至神經細胞內，進而發(fā)揮作用[14]。PLCB1是目前研究最廣泛的磷脂酶C（PLC）亞型，在調節(jié)核肌醇酯信號轉導中起著關鍵作用[15]。汪穩(wěn)[16]研究發(fā)現(xiàn)， PLCB1基 因在23、36、50周齡番鴨卵巢組織中的表達量存在顯著差異（ P< 0.05），與產蛋期相比就巢期和青年期番鴨卵巢組織中 PLCB1 基因的表達量較低，即 PLCB1在產 蛋期卵巢中的表達量高于青年期和就巢期，提示該基因可能在番鴨產蛋過程中起到較強的調節(jié)作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，豬顆粒細胞和卵母細胞中PLC抑制劑和激活劑對4種PLC亞基的基因和蛋白表達有所不同，激活劑處理促進了4種PLC亞基的基因表達，但只有PLCB1蛋白有變化，這表明PLC蛋白中不同亞基發(fā)揮的作用有所不同，并且 PLCB1 可能在豬卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮主要作用[17]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3（STK3）是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族STE20的成員之一，SKT3在細胞質和細胞核中均有表達，其主要功能是促使核小體間DNA碎片化，可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡[18]。Moon等[19]研究了STK3在發(fā)情周期小鼠子宮內膜中的調控和表達，結果發(fā)現(xiàn)STK3在發(fā)情周期子宮中的表達是動態(tài)變化的，STK3蛋白表達從發(fā)情間期開始逐漸增加，發(fā)情期達到最高，表明STK3/4-Hippo信號通路在子宮上皮中起著新的信號通路作用，STK3/4-Hippo信號通路是連接雌激素下游信號通路和Hippo信號通路的關鍵因子之一，從而調節(jié)發(fā)情周期中子宮上皮的動態(tài)平衡。此外，有研究者利用全基因組測序技術從大足黑山羊中篩選出與產羔數相關的候選基因 STK3， GO分析發(fā)現(xiàn)其富集在生殖過程相關的途徑中，表明 STK3可 能是調控大足黑山羊產羔數的一個重要候選基因[10]。

小尾寒羊具有生長發(fā)育快、繁殖力高、性能遺傳穩(wěn)定、適應性強等優(yōu)點，目前關于 PPP3CA、PLCB1、STK3 基因在小尾寒羊性腺軸相關組織的表達研究尚未見文獻報道。筆者選擇 FecB? BB型（多羔純合突變型）和 FecB? ++型（單羔純合野生型）卵泡期小尾寒羊作為研究對象，采用實時熒光定量PCR技術檢 測PPP3CA、PLCB1、STK3基 因在小尾寒羊性腺軸各組織中的表達情況，以期為小尾寒羊多羔候選基因的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和樣品采集

選取2～3周歲健康狀況良好、經產的6只小尾寒羊母羊用于試驗，其中卵泡期 FecB? BB型（突變型）和 FecB? ++型（野生型）各3只。所有試驗羊只由天津市畜牧獸醫(yī)研究所試驗羊場提供，于2017年10月飼養(yǎng)，所有試驗羊只的飼糧水平和飼養(yǎng)環(huán)境均保持一致。2017年11月將試驗羊只屠宰，屠宰后迅速采集其大腦、小腦、下丘腦、垂體、卵巢、子宮、輸卵管等組織，然后裝入1.8 mL無菌、無酶凍存管中（采集樣品量不超過凍存管容積的2/3）[20]，迅速放入液氮罐中冷凍保存，并帶回實驗室放入-80 ℃冰箱中冷凍備用。

1.2 RNA提取及質量檢測

將采集的組織樣品在液氮中研磨，并用Trizol試劑（Invitrogen，美國）進行裂解，然后根據動物組織總RNA提取試劑盒（天根，北京）說明書進行總RNA提取。總RNA提取完成后利用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質量，并使用NanoDrop 2000分光光度計檢測提取RNA的質量和濃度。將無明顯降解、OD260/OD280為1.8～2.2的RNA置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 cDNA合成

以1.0 μg總RNA作為模板，使用TaKaRa PrimeScriptTM RT Reagent Kit試劑盒進行反轉錄合成第一鏈cDNA。反轉錄

體系（20 μL）如下：5×PrimeScript Buffer 4.0 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μL，Oligo dT Primer 1.0 μL，Random 6 mers 1.0 μL，RNA 1.0 μg，RNase-Free ddH2O將反應總體積補至20 μL。反應程序如下：37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s。反轉錄全程快速在冰上進行。將反轉錄所得cDNA進行5倍稀釋，用持家基因 RPL-19進 行PCR產物檢測，經檢測合格后于-20 ℃下保存，作為后續(xù)實時熒光定量檢測的模板[20]。

1.4 熒光定量PCR引物設計

根據GenBank數據庫提供的綿羊 PPP3CA、PLCB1、STK3和RPL-19基 因序列（登錄號分別為XM_027970857.1、XM_012188093.3、XM_027973184.1和XM_004012836.3）信息，熒光定量引物使用Primer Premier 5.0軟件設計，以 RPL- 19作為持家基因。引物合成由北京天一輝遠生物科技有限公司完成。所有引物均加水稀釋至濃度10 μmol/L。引物詳細信息見表1。

1.5 實時熒光定量PCR

以 RPL- 19基因作為持家基因，使用Roche Light Cycler480 Ⅱ 型熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR。反應體系（20 μL）如下：TB Green Premix Ex? Taq? Ⅱ 10 μL，PCR Primer（Forward Primer &Reverse Primer）0.8 μL，cDNA 模板2.0 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL。熒光定量PCR反應程序如下：95 ℃ 預變性5 s;95 ℃變性10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán);反應結束后，對熔解曲線進行分析。

1.6 標準曲線的繪制

取適量cDNA樣本，2倍等比稀釋，制備5個濃度梯度[1、1/2、（1/2）2、（1/2）3、（1/2）4]的cDNA樣本。將這些cDNA作為模板，對目的基因和內參基因進行熒光定量PCR。以 Ct 值為縱坐標，以濃度梯度的對數值（以10為底數）為橫坐標，繪制目的基因和內參基因 RPL-19 的標準曲線[20]。

1.7 數據統(tǒng)計與分析

目的基因的相對表達量采用2-ΔΔ Ct 法計算。使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用 t 檢驗進行差異顯著性分析。 P< 0.05表示差異顯著， P< 0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取 利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行總RNA的質量檢測，電泳結果顯示28S條帶明顯亮于18S條帶，表明RNA完整性較好，提取的RNA質量合格，可用于后續(xù)反轉錄及熒光定量PCR試驗。

2.2? PPP3CA、PLCB1和STK3 基因在不同基因型小尾寒羊各性腺軸組織中的表達量分析

2.2.1? PPP3CA 在不同基因型小尾寒羊各性腺軸組織中的表達量分析。實時熒光定量PCR結果表明， PPP3CA 基因在BB型小尾寒羊卵巢中的相對表達量最高，在++型小尾寒羊子宮中的相對表達量最低。 PPP3CA 基因在 FecB? BB型小尾寒羊下丘腦中的相對表達量顯著高于++型（ P< 0.05），在 FecB? BB型小尾寒羊輸卵管中的相對表達量極顯著高于++型（ P< 0.01）（圖1）。

2.2.2? PLCB1 基因在不同基因型小尾寒羊各性腺軸組織中的表達量分析。實時熒光定量PCR結果顯示， PLCB1基 因在 FecB? BB型小尾寒羊小腦中的相對表達量最高，其在 FecB? BB型小尾寒羊垂體和卵巢組織中的相對表達量顯著高于++型（ P< 0.05）（圖2）。

2.2.3? STK3 基因在不同基因型小尾寒羊各性腺軸組織中的表達量分析。 STK3 基因在 FecB? ++型小尾寒羊大腦中的相對表達量最高，其在++型和BB型小尾寒羊大腦、小腦、下丘腦、垂體、卵巢、子宮、輸卵管中均有表達。 STK3 基因在 FecB? BB型小尾寒羊卵巢中的相對表達量極顯著高于++型（ P< 0.01）（圖3）。

3 討論

下丘腦-垂體-性腺軸（HPGA）的調節(jié)是控制哺乳動物繁殖力的關鍵，是調控哺乳動物性激素分泌最重要的系統(tǒng)[21]。PPP3CA是蛋白磷酸酶3（protein phosphatase 3，PPP3）的催化亞基A。在蛋白磷酸酶3催化（PPP3C）的3種亞基中，PPP3CA和PPP3CB廣泛存在于真核生物的多種細胞中[22]，其中 PPP3CA基 因已被證實參與牛肌肉前脂肪細胞的分化[23]。 PPP3CA 在動物生殖生理中扮演著重要的角色，包括其在調節(jié)血管內皮生長因子 （VEGF） 和成纖維細胞生長因子2 （FGF2） 刺激胎盤動脈內皮細胞增殖和信號轉導中的作用[24]。在精子發(fā)生過程中 PPP3CA通 過去磷酸化來調節(jié)精子的減數分裂，另外有研究發(fā)現(xiàn) PPP3CA 的SNP變異與豬的產仔數有關[10]。該研究中 PPP3CA 基因在BB型小尾寒羊下丘腦中的相對表達量顯著高于++型（ P< 0.05），其在BB型小尾寒羊輸卵管中的相對表達量極顯著高于++型（ P< 0.01），且該基因在 FecB? BB型小尾寒羊卵巢中的相對表達量較++型小尾寒羊有所增加，提示該基因可能通過小尾寒羊性腺軸相關組織上的表達來正向調節(jié)小尾寒羊的繁殖性狀。敖葉等[25]研究發(fā)現(xiàn)， PPP3CA 基因在單羔組黔北麻羊卵巢、輸卵管、下丘腦中的相對表達量顯著高于多羔組（ P< 0.05），與該研究結果有一定差異，推測這種差異可能是由于物種不同所致。

PLCB1基 因在Wnt/Ca2+通路中起重要作用，PLC酶負責內膜組分磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP 2）通過水解產生第二信使IP3和DAG，這2種酶都導致細胞內Ca2+的釋放，而Ca2+穩(wěn)態(tài)可能在卵母細胞和胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用[26-27]。有研究者利用RNA-seq和全基因組甲基化測序方法對不同光周期條件下綿羊下丘腦表觀遺傳變化進行研究，篩選出參與光周期調控綿羊下丘腦功能的主要mRNAs（如 PLCB1、RASD1和KCNJ5 等），光周期改變時 PLCB1 參與了胰島素分泌，該結果表明在晝夜節(jié)律通路中一些關鍵基因的表達變化會促進胰島素的分泌，從而激活下丘腦功能區(qū)的受體，進一步調節(jié)綿羊因光周期誘導而進行的一系列生殖活動[28]。另有研究發(fā)現(xiàn) PLCB1 在癌變過程中上調[29];Molinari等[30]指出 PLCB1在 乳腺癌中拷貝數的變化，其表達水平與組織學分級和增殖指數有關。汪穩(wěn)[16]研究發(fā)現(xiàn) PLCB1 基因可能在番鴨產蛋過程中起到較強的調節(jié)作用。陳華麗[17]研究表明 PLCB1基因可 能在豬卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮主要作用。該研究中 PLCB1 基因在 FecB? BB型小尾寒羊小腦中的相對表達量高于其他性腺軸組織，其在 FecB? BB型小尾寒羊垂體和卵巢組織中的相對表達量顯著高于++型（ P< 0.05），推測該基因對小尾寒羊的高繁殖力性狀具有一定的促進作用。

STK3是Hippo信號通路的一個關鍵分子，它控制細胞的發(fā)育、增殖、凋亡以及各種應激反應[31]。目前，關于STK3的研究主要集中在癌癥方面。Wang等[32]研究發(fā)現(xiàn)，STK3抑制卵巢癌細胞增殖和轉移，卵巢癌細胞過表達 STK3 后，細胞周期阻滯于G2/M期，細胞凋亡率增加。然而，關于 STK3 基因在動物繁殖方面的報道較少。研究表明，含WW結構域的人同源重組蛋白1（SAV1）在體外顯著促進了STK4或STK3激酶誘導的大腫瘤抑制激酶1（LATS1）的磷酸化，LATS1的磷酸化和活性抑制卵巢卵泡的發(fā)育，從而阻止卵巢發(fā)育過程中的卵泡選擇[33-34]。E等[10]基于全基因組測序結果篩選出大足黑山羊的多羔候選基因 STK3 ，與該研究結果相一致。實時熒光定量PCR結果顯示，小尾寒羊性腺軸各組織中 STK3 基因均有一定表達，其在 FecB? BB型小尾寒羊卵巢中的相對表達量極顯著高于++型 （ P< 0.01），提示該基因可能是調控小尾寒羊多羔性狀的一個重要候選基因。

4 結論

PPP3CA、PLCB1、STK3基 因在小尾寒羊性腺軸各組織中均有表達。

PPP3CA 基因在小尾寒羊下丘腦、輸卵管中的相對表達量在單羔和多羔群體間存在顯著差異， PLCB1 基因在單羔和多羔群體垂體組織中的相對表達量存在顯著差異， PLCB1和STK3 基因在單羔和多羔群體卵巢組織中的相對表達量存在顯著差異。該研究結果表明 PPP3CA、PLCB1、STK3 基因可作為調控小尾寒羊多羔性狀的重要候選基因，為闡明綿羊高繁殖力的分子機理提供了一定參考。

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