基于網絡藥理學和高分辨質譜分析半夏厚樸湯潛在藥效成分

生立嵩，蘇酩，謝亞欣，2，張新軍，彭麗，許祚芝，劉善新*

(1.山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014；2.山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；3.華潤雙鶴利民藥業(濟南)有限公司 質量部，山東 濟南 250200)

半夏厚樸湯始載于漢張仲景《金匱要略》“婦人咽中如有炙臠，半夏厚樸湯主之”，處方為半夏一升、厚樸三兩、茯苓四兩、生姜五兩、蘇葉二兩,有行氣散結、化痰降逆的功效，近代以來主要治療梅核氣[1]。現代該方應用廣泛，臨床研究用于治療抑郁癥[2]、反流性食管炎[3]、睡眠呼吸暫停綜合征[4]、咳嗽[5]等。前期本課題組結合臨床應用，篩選半夏厚樸湯抗PDE4(磷酸二酯酶4)活性成分，并以液相色譜-質譜聯用分析提取其中成分[6]，但對應化合物數量較少，種類單一，這提示所選靶點及潛在藥效成分存在一定問題。鑒于此，我們以計算機虛擬篩選與高分辨質譜檢測相結合的方法，應用網絡藥理學搜集半夏厚樸湯藥材的成分及其作用靶點；采用TCMIO(中藥免疫腫瘤學數據庫)等中藥成分數據庫和軟件進行預測和分析，預測半夏厚樸湯主要作用靶點；為研究組方中小分子與蛋白的相互作用機制，對半夏厚樸湯中已報道化合物[7]進行分子對接擬合和親和能打分，篩選親和能值較低的化合物。以高分辨質譜法分析半夏厚樸湯提取物的成分及含量，篩選提取物中含量較高且在虛擬篩選中親和能值較低的作為半夏厚樸湯的潛在藥效成分組。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

DNA503型千分之一電子天平(南京伯尼塔科學儀器有限公司)；KDM型控溫電熱套(鄄城華魯電熱儀器有限公司)；KQ-250DA型數控超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；Q-Exactive型超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱質譜儀(美國賽默飛公司)。

1.2 試藥

茯苓(批號201001)、厚樸(批號200502)、半夏(批號191201)、生姜(批號200702)、蘇葉(批號200501)均購自山東建聯盛嘉中藥有限公司，由濟南億民藥業有限公司冉蓉高級工程師鑒定，均為2020年版《中國藥典》一部收載的正品。

1.3 研究工具

數據庫：中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，https://tcmsp-e.com/)、中藥免疫腫瘤學數據庫(TCMIO，http://tcmio.xielab.net/)、藥物化學數據庫(ChemBL, https://www.ebi.ac.uk/)、RCSB PDB(https://www.rcsb.org/)、STRING(https://www.string-db.org/)；數據及化合物處理軟件：Discovery Studio 2016單機版、AutoDockTools 1.5.6、AutodockVina 1.1.2、Cytoscape 3.6.1；質譜分析軟件：Compound Discoverer 3.0、Xcalibur 3.0.63。

2 方法與結果

2.1 成分數據庫搜索和建立

從TCMSP、TCMIO等數據庫中搜集半夏厚樸湯五味藥材的報道成分，下載所有成分mol2格式文件，采用Autodock自帶的raccoon軟件處理結構，生成pdbqt格式文件，作為對接成分分子數據庫。共得到五味藥材所報道化合物402個，主要包括黃酮類、三萜酸類、甾醇類、有機酸類等。

2.2 網絡藥理學研究和靶點收集

本研究采用兩種方法[8-9]搜集半夏厚樸湯的潛在靶點：(1)從藥效成分入手，選擇TCMSP數據庫中半夏厚樸湯五味藥材已報道化合物，選擇其中成藥性良好(OB≥30%且DL≥0.18)的化合物對應靶點，將這些靶點與Genecards網站中，與咳嗽(關鍵詞cough)和神志疾病(關鍵詞mental disease)相關靶點進行Venn交集，重疊靶標在STRING數據庫中構建PPI(protein-protein interaction)網絡，經Cytoscape進行拓撲分析后，選擇拓撲值較高的作為半夏厚樸湯候選靶點；(2)從所有報道成分入手，選擇TCMSP數據庫中每味藥材所有報道化合物的靶點，將每個化合物所對應的靶點進行加和統計，選擇相關度最高的作為半夏厚樸湯潛在靶點。

在TCMSP數據庫中，共收集到成藥性良好分子44個，這44個分子對應的靶點共有121個，采用Venn 圖分析半夏厚樸湯可能作用的靶點數量，結果如圖1所示，藥效成分的預測靶標和咳病(cough)、神志疾病(mental disease)二者的共有靶標21個。運用STRING 網絡平臺進行重疊靶標的PPI網絡構建，同時使用Cytoscape的network analyse功能對PPI網絡進行分析，結果見表1，度值(degree)排名前2的靶標分別是IL6和VEGFA。基于總體成分預測的靶點加和后結果如表2所示，排名最靠前的是GABR和PTGS兩個靶標。綜合上述網絡藥理學研究，以這4個靶點作為半夏厚樸湯作用的潛在靶點。

圖1 Venn網絡圖

表1 基于藥效成分的預測靶標

表2 半夏厚樸湯成分相關靶蛋白及關聯度

2.3 分子對接

對2.2節中篩選的潛在靶點，參考Autodock軟件[7]的說明進行分子處理和對接操作：從RCSB(protein data bank description)網站中搜集相關靶點蛋白的結構，以蛋白自帶的配體結構和位點作為結合域，以Autodock軟件對蛋白質進行去水、加氫、加電荷操作。以Autodock vina 4.1軟件，利用蛋白質晶體中自帶的抑制劑位置作為結合位置，設置結合位點和結合范圍大小，Docking算法采用local search以提高計算速度。利用2.1節搜集的藥材報道化合物分子進行分子對接，將所有結果的親和能值(affinity，kJ/mol)進行排序，選擇親和能值較低的前10%作為潛在有效化合物。

分子對接主要參數如表3所示，每個靶點結合能最低的前10個化合物結果如表4所示，4個靶點中對接較好的化合物為黃酮類和黃酮苷類，其次為三萜酸類和有機酸酯類。其中有3個黃酮類化合物在3個靶點中對接表現較好，這可能是PAINS[10]類化合物，也可能是藥物潛在有效分子。其中打分最優化合物與靶點對接的二維圖如圖2所示。

表3 分子對接參數

表4 半夏厚樸湯與候選靶點分子對接結果

注：灰色線代表小分子結構圖；粉色、紫色、深粉色虛線代表疏水作用力；深綠色虛線代表氫鍵作用力；淺綠色虛線代表范德華力；深紅色代表unfavorable donor-donor 作用。

2.4 飲片提取和樣品制備

表5 樣品提取方法

2.5 高分辨質譜及CD分析

色譜柱Thermo Scientific Hypersil(100 mm×2.1mm)；流動相為0.5%甲酸溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～27 min，流動相A 10%～90%)，條件如下所示：流速0.3 mL/min；質譜條件掃描范圍80～1 200m/z；源內誘導碰撞解離電壓(CID)0.0 eV；分辨率70 000；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；正/負離子檢測，進樣量5 μL。

參考文獻[11]方法使用Compound Discoverer軟件分析質譜數據，采用chemspider、m/zcloud等質譜數據庫匹配化合物。使用Xcalibur軟件對檢測數據進行處理。選擇m/zcloud best match 打分≥70.0分的化合物，認為有較高的匹配度。

將高分辨質譜數據經Compound Discover 3.0軟件分析后共收集高匹配度化合物176個，經比對，發現有19個化合物在半夏厚樸湯報道成分數據庫中，這些成分在既往研究中已證實存在于半夏厚樸湯成分藥材中，又能在提取物中被檢測到，因此可認為是半夏厚樸湯的潛在有效成分組，具體結果見表6，其中有3個在分子對接中表現較好(分子對接打分前10%)：野黃芩苷，芹菜素，熊果酸。含上述化合物的高分辨質譜圖結果如圖3所示。

表6 半夏厚樸湯潛在有效成分組的親和能

注：①—野黃芩苷；②—芹菜素；③—熊果酸。

以19個對應化合物的親和能和離子峰面積賦權作為指標，一般認為，親和能和結合能力呈對數關系，所以賦權公式按下式計算：

式中，S為以潛在有效成分指標的分子對接親合能賦權值，i為化合物編號，A為離子峰面積，Af為親和能。計算結果見表7。

表7 潛在有效成分的親和能賦權值

3 討論和結論

本文采用整合藥理學方法，結合半夏厚樸湯傳統和現代臨床應用分析其潛在靶點，這些靶點涉及神經系統、免疫系統，采用虛擬篩選和分子對接技術，篩選半夏厚樸湯潛在有效成分，在篩選中表現良好的化合物主要包括黃酮類、三萜酸類等，其中熊果酸[12-13]、芹菜素[14]、野黃芩苷[15]等均有文獻報道參與IL6、PTGS等靶點和信號通路的作用。采用高分辨質譜方法和化合物匹配軟件，分析了不同提取方法下半夏厚樸湯的成分，其中有121個匹配打分超過70.0分，有19個與半夏厚樸湯藥材報道成分吻合，有3個虛擬篩選打分靠前(前10%)。結合中藥傳統應用方式，認為這些化合物可能共同形成半夏厚樸湯潛在藥效成分組。

在本研究中，采用多種方法開展網絡藥理學靶點富集。最終搜集的4個靶點中，有3個為常見的炎癥、免疫相關信號通路，而GABR則為中醫神志病常見靶點，這與半夏厚樸湯用于抑郁癥的臨床應用契合較好。說明本研究中網絡藥理學分析方法可靠，結果可信，在一定程度上彌補了近年來腫瘤免疫學研究的不足，為后續的小分子虛擬篩選提供了較為可靠的靶點結論。

中藥成分復雜，藥理作用廣泛，在特定疾病的治療中具備獨特優勢。中藥成分發揮藥理作用，往往需要達到特定的劑量，本文研究過程中，對所涉及潛在有效化合物定量研究未能開展，發揮藥效的劑量因素，還要進一步查閱文獻。本文以不同溶劑提取半夏厚樸湯，采用高分辨質譜分析，可比較其中特定成分的大小差異，為后續的提取工藝研究奠定基礎。

目前的中藥系統藥理學和網絡藥理學研究中，對中藥的生物信息學研究較多，而對發揮藥理作用的物質基礎部分，即成分的研究重視程度還不夠，在篩選得到潛在有效靶點和相關化合物后的分子對接、靶點的結合域選擇、親和能等主要指標相對比較籠統，也往往不對靶蛋白自帶的抑制劑小分子進行對照研究以保證分子對接的可靠性。在本研究中，為克服對接分子數量少帶來的數據偏差，引入虛擬篩選功能，對文獻報道的全部四百多個化合物均進行對接運算，這樣既能兼顧靶點的全面性，又能有效地衡量化合物針對特定靶點的有效性。相較而言，采用本研究方法更能篩選得到有較高活性的潛在有效化合物。

本研究確定了半夏厚樸湯發揮藥效的潛在活性成分(組)，但這些成分是否能有效代表半夏厚樸湯的絕大多數藥理活性還不得而知。后續的藥理實驗和分子生物學分析有待開展，希望通過后續藥效學驗證，對本文中所發現的潛在活性成分組進行深入研究，驗證成分組是否能真正代替半夏厚樸湯整體藥效，以及這些成分的具體藥理活性。