基于網絡藥理學和分子對接研究三七抗類風濕關節炎的分子機制

張瀟文，應天昊，梁美辰，王艷芳，王信林，張雷明

(煙臺大學 藥學院 分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室，山東 煙臺 264005)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種全身性自身免疫性疾病，屬于中醫學“痹癥”的范疇，其主要臨床表現為侵蝕性、對稱性多關節炎。目前，類風濕關節炎的確切發病機制尚不明確，主要病理表現為關節滑膜的慢性炎癥、血管翳形成，并逐漸出現關節軟骨和骨破壞，后期發展為進行性關節損傷、功能喪失合并癥[1]。類風濕關節炎可見于各個地區和種族，目前患病人數約占世界總人口的1.0%[2]。

中醫藥具有多靶點、多途徑、多環節以及整體調節的特點，相比于傳統化學藥物的治療，中藥對RA的治療具有一定的優勢，臨床實踐證明，無論內服、外用、單方或聯合等中醫藥治療都取得了明顯療效。中醫藥治療避免了化學藥的毒副作用，適宜長期服用，具有明顯優勢[3]。三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)為五加科人參屬植物三七的干燥根，具有抗血栓、抗炎、抗纖維化、調節免疫等作用，逐步被應用于臨床，其在類風濕關節炎治療方面也越來越受重視[4]。三七的藥理作用主要體現在對血液系統、心腦血管系統、中樞神經系統、免疫系統等的影響[5]。三七的主要活性成分為三七總皂苷[6]，具有抗炎、改善細胞能量代謝、清除自由基及抗氧化應激、調控細胞凋亡信號通路、平衡離子代謝紊亂、改善組織血流供應等藥理作用[7-12]，臨床上常用于治療心腦血管及神經系統疾病,亦可用于類風濕關節炎等自身免疫疾病[13]。

運用網絡藥理學的方法研究中藥的結構、功效，彌補了以往中藥研究中單靶點、單通路的思維缺陷。本研究擬采用網絡藥理學的方法揭示三七抗類風濕關節炎的分子機制，為新藥研發及深入研究三七的作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 三七活性成分及其作用靶點的篩選

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索三七的主要成分，以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%及類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18為篩選條件，獲得三七的主要活性成分。通過主要活性成分的編號(MOLID)，在TCMSP數據庫的相關靶點檢索功能(related targets)檢索主要活性成分的潛在靶點，去除沒有檢索到靶點的活性成分，依次得到7種主要活性成分對應的潛在作用靶點。篩選結束后，統一應用Uniprot蛋白質數據庫(https://www.uniprot.org)將活性成分作用的蛋白質靶點進行規范，標準化蛋白質靶點信息，以便后續研究。

1.2 類風濕關節炎相關靶點的篩選

以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞，在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org)中檢索類風濕關節炎的潛在靶點。在GeneCards數據庫中，Score值越高則代表該靶點與疾病聯系越密切。

1.3 三七活性成分-類風濕關節炎交集靶點篩選

利用R語言將三七活性成分作用靶點和類風濕關節炎作用靶點取交集并繪制維恩圖，兩者交集部分即為三七抗類風濕關節炎的潛在作用靶點。

1.4 三七活性成分-類風濕關節炎靶點PPI網絡的構建

將交集靶點提交至STRING 11.0數據庫(https://string-db.org)構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡模型，將生物種類設定為“Homo sapiens”，得到PPI網絡。

1.5 三七活性成分-類風濕關節炎靶點生物功能與通路的富集分析

Metascape平臺(http://metascape.org)可對靶點進行通路富集分析。將交集靶點導入Metascape平臺進行GO(gene ontology)及KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析，設置P< 0.01，分析其主要的生物學過程與代謝通路并進行富集分析，保存其結果并通過R語言對結果進行可視化。

1.6 三七活性成分-類風濕關節炎靶點-通路網絡圖的構建

運用Cytoscape 3.7.2構建三七活性成分-類風濕關節炎靶點-通路網絡圖，利用Cytoscape 3.7.2內置工具分析有效成分及靶點的網絡拓撲參數，包括連接度(degree)、介度(betweenness)及緊密度(closeness)等，并根據網絡拓撲學參數判斷核心靶點及發揮藥效的主要活性成分。

1.7 分子對接

從PPI及成分-靶點-通路網絡圖中選取關鍵靶點分別與關鍵成分進行分子對接，驗證成分與靶點之間的可能性。從 Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb)數據庫中檢索獲得受體蛋白(PDBID: 1UNQ)，利用AutoDock Vina 1.1.2對受體蛋白與配體小分子進行分子對接，對結合自由能進行打分。

2 結果

2.1 三七的活性成分及其作用靶點

在TCMSP數據庫中根據OB和DL參數篩選初步獲得8個成分，剔除1個未查詢到靶點的成分，最終獲得7個活性成分(表1)。對上述7個成分作用靶點加以預測，得到三七活性成分作用靶點202個，刪除重復值后共得到靶點154個。利用Cytoscape 3.7.2對三七活性成分及其作用靶點的關系網絡進行繪制和分析，共獲得161個節點(包含154個靶點和7個活性成分)與202條邊，圖中節點的大小代表相應的連接度值，節點面積越大代表連接度值越大，表示涉及的生物功能越多，其生物學重要性越高(圖1)。

表1 三七活性成分

注: 圖中紫色代表活性成分作用的靶點；黃色代表7個活性成分。

2.2 類風濕關節炎相關靶點

從GeneCards數據庫獲得類風濕關節炎靶點4 465個。設定Score大于中位數的目標靶點為類風濕關節炎的潛在靶點，如通過GeneCards所得類風濕關節炎靶點Score最大值為110.06，最小值為0.15，中位數為1.44，故設定Score ≥1.44的靶點為類風濕關節炎的潛在靶點，最終得到2 237個類風濕關節炎相關靶點。

2.3 三七活性成分-類風濕關節炎靶點網絡構建

應用R語言將三七活性成分和類風濕關節炎相關的作用靶點取交集，繪制維恩圖(圖2)，得到交集靶點100個，即三七活性成分抗類風濕關節炎作用的潛在靶點。

圖2 三七活性成分-類風濕關節炎靶點維恩圖

2.4 三七活性成分-類風濕關節炎靶點PPI網絡的構建

將篩選得到的三七活性成分-類風濕關節炎100個交集靶點提交至 STRING 11.0平臺，限定物種為“人”，選擇交互作用大于0.4的靶點得到三七靶點PPI網絡圖數據。為了更加清楚地體現核心蛋白在PPI中的調控作用，通過Cytoscape 3.7.2進行可視化分析并通過內置的Network Analyzer分析得到最終PPI網絡(圖3)。共有98個節點，1 751條邊。圖中節點大小和顏色表示靶點的度值，節點越大，顏色由淺黃到橙色，表示靶點連接度值也就越大，反之表示越小。由圖3可以看出，AKT1、IL6、VEGFA、TNF、TP53、JUN、CASP3、PTGS2等目標基因位于網絡的核心位置，在PPI網絡中發揮關鍵調控作用。

圖3 三七-類風濕關節炎靶點PPI網絡

2.5 三七抗類風濕關節炎潛在靶點生物功能與通路的富集分析

利用Metascape平臺，將三七活性成分與類風濕關節炎交集靶點進行GO的生物過程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)和細胞組分(cell component, CC)富集分析，將P<0.01的項目進行篩選，總共富集到1 791條生物過程，131項分子功能相關，66項細胞組分相關。使用R語言按照富集的顯著程度取排名前10的項目進行柱狀圖繪制(圖4)。KEGG通路分析按P<0.01進行篩選，總共富集到304條信號通路，篩選排名前20的通路進行氣泡圖繪制(圖5)。

圖4 GO分析

圖5 KEGG通路富集分析

2.6 三七活性成分-類風濕關節炎靶點-通路網絡圖的構建

運用Cytoscape 3.7.2構建三七成分-類風濕關節炎靶點-通路網絡(圖6)。通過 Cytoscape 3.7.2內置的Network Analyzer分析三七治療類風濕關節炎網絡拓撲學參數，得到核心成分及核心作用靶點。三七治療類風濕關節炎的核心成分為槲皮素、人參皂苷rh2和β-谷甾醇等(表2)，最主要靶點為AKT1、RELA、MAPK1、CHUK、IL6、CASP3、JUN、NFKBIA、TNF、TP53等(表3)。

注:不同顏色的圓形節點為不同藥物的活性成分，矩形為靶點，倒三角為通路；節點的面積及顏色透明度其代表其度數，面積越大、顏色越深說明該節點越重要。

表2 三七主要活性成分網絡節點特征參數

表3 三七主要活性成分靶點網絡節點特征參數

2.7 分子對接結果

使用AutoDock Vina軟件對關鍵靶點和成分進行分子對接后，得到結合自由能打分，如表4所示，能值越低，表明二者的結合效果越好。表中AKT1與人參皂苷rh2和豆甾醇結合性最好，如圖7所示，從圖中可以看出AKT1與兩種成分相互作用，結合后呈現穩定狀態。

表4 與關鍵靶點AKT1的對接結果

圖7 化學成分與AKT1的分子對接圖

3 討論

本研究篩選得到的活性成分主要有槲皮素、人參皂苷rh2、β-谷甾醇、豆甾醇、亞油酸乙酯、甘草素。槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，廣泛存在于植物的花、葉、果實中，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗纖維化等藥理作用[14]，可以減輕大鼠急性痛風性關節炎的踝關節腫脹程度，并且能夠降低炎癥因子IL-1β、TNF-α、COX-2、NO的水平[15]，提示其具有抗類風濕性關節炎的潛力。人參皂苷Rh2具有抗氧化和抗炎的作用[16]，可以顯著抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α[17]，并且可以減少肺組織中LPS誘導的促炎性NO、腫瘤壞死因子-α的分泌，降低白介素IL-1β和IL-4、IL-6和IL-10水平[17]。β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，屬于四環三帖類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血脂等藥理作用[18]。豆甾醇是植物甾醇之一，常和油脂共存于許多植物種子和花粉中，能抑制多種炎癥介質，從而減少骨關節炎引起的軟骨退化，并可以通過阻斷IL-1β誘導的NF-κB通路來發揮其抑制作用[19]。亞油酸乙酯是人體必需脂肪酸之一，有降低血清膽固醇和低密度脂蛋白、抗菌、抗炎等藥理作用，可用于治療動脈硬化、心絞痛等。亞油酸乙酯對鈦顆粒和LPS誘導的細胞炎性因子的釋放均有抑制作用，從而可以減輕炎癥反應[20-21]。甘草素是從中藥甘草中提取的一種黃酮類化合物單體，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用[22]，對LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞損傷具有保護作用[23]。

本研究篩選得到三七-類風濕關節炎共同作用靶點100個，其中核心靶點包括AKT1、IL6、VEGFA、TNF、TP53、JUN、CASP3、PTGS2。為了進一步研究共同作用靶標在基因功能和信號通路方面的作用，進行了GO分析和KEGG分析。GO分析共獲得1064條信號通路，KEGG分析獲得102條信號通路，其中與類風濕關節炎相關的信號通路包括AGE-RAGE、MAPK、TNF、IL-17以及HIF-1等。AGE(糖基化終產物)-RAGE(糖基化終產物受體)信號通路在糖尿病及其并發癥的形成與發展中發揮重要作用，AGEs可以激活RAGE，會引起輕度全身性炎癥反應和氧化作用[24]，三七皂苷等復方制劑可以降低AGE和RAGE的表達[25]。MAPK信號通路被激活后會產生大量促炎性細胞因子和MMP(基質金屬蛋白酶)，促進成纖維樣細胞的遷移和侵襲，導致滑膜炎癥、關節破壞[26-27]。TNF信號通路中，TNF-α能促進軟骨破壞，加重炎性反應，促進類風濕關節炎的發生。在類風濕關節炎活動期及進展期，TNF-α表達明顯增加[28]。IL-17信號通路是Th17細胞活化和維持的關鍵通路，在類風濕性關節炎等多種炎癥性疾病中，尤其是在類風濕關節炎關節癥狀的形成中發揮重要作用[29-30]。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β組成，HIF-1α在小鼠膝關節炎中表達明顯升高[31]。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學和分子對接闡釋了三七的活性成分、靶點及通路之間相互作用的關系，三七的活性成分可通過多靶點、多通路發揮抗類風濕關節炎效應，為三七治療類風濕關節炎的開發及應用提供了理論依據。