銀杏內酯C標準樣品的研制

寧凡盛，路巖翔，曹桂云，孟兆青，閆慧嬌，王岱杰

(1.齊魯工業大學(山東省科學院)a.山東省分析測試中心; b.藥學院，山東 濟南 250014；2.濟南市行政審批服務局，山東 濟南 250001；3.山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，山東 濟南 250000)

銀杏葉由銀杏科植物銀杏GinkgobilobaL.的葉子干燥而成[1]，是目前中藥常用品種，具有活血化瘀、通絡止痛、斂肺平喘、化濁降脂的功效[2-5]?，F代藥理研究表明，銀杏葉提取物能夠抗氧化、抗衰老、降血壓、促進血液循環、提高腦部功能[6-8]。銀杏內酯C是銀杏葉中主要的活性成分，是控制藥材質量和成藥標準的重要指標[9-11]。銀杏內酯是一類具有特殊分子結構的二萜內酯類化合物，銀杏葉制劑的療效和內在質量是由銀杏內酯的含量決定的[12]。目前國內市場上的銀杏內酯C以對照品為主，純度在85%～98%，級別參差不齊，未按照國標的要求對其進行相關標準品評測，樣品不具有溯源性[13-16]。為滿足銀杏、銀杏葉及其他含有銀杏內酯C藥材的成分分析、樣品檢測、質量控制等需求，保證結果的可比性、準確性和溯源性[17]，急需對銀杏內酯C進行標準樣品的制備研究。

GB/T 15000.2—2019《標準樣品工作導則第2部分：常用術語及定義》[18]中關于標準樣品的定義是：足夠均勻的一種或多種，具有化學的、物理的、生物學的、工程技術的或感官的等性能特征，經技術鑒定，附有說明相關性能數據證書的樣品。標準樣品可以對儀器進行校準，對相關測量方法進行評價和對材料賦值[19-22]。天然產物標準樣品是天然產物質控方面確認產品質量不可或缺的參照物，具有高度均勻性和良好的穩定性。但我國目前已研發出的天然產物標準樣品，無論在種類還是在數量上均嚴重不足，直接給相關產品的檢驗和檢測帶來困擾，同時還制約了相關檢測和質控行業的發展[23]。本文為解決銀杏內酯C標準品缺乏的問題，參照GB/T 15000.3—2008《標準樣品工作導則(3)標準樣品 定值的一般原則和統計方法》[24]，成功研制出滿足國家標準的銀杏內酯C樣品，其結構見圖1。

圖1 銀杏內酯C的化學結構式

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

DZKW-C恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；旋轉蒸發儀R-3(瑞士Buchi公司)配有V-700真空泵(瑞士Buchi公司)；DLSB-5/20低溫冷卻液循環泵(鄭州長城科工貿有限公司)；DHG-9070A電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；Shimadzu LC-6AD高效液相色譜系統(日本Shimadzu公司)；Agilent 1220高效液相色譜儀(美國Agilent科技公司)；島津TG-40 DTA-40M 熱重分析儀(日本Shimadzu公司)；Elementar全自動元素分析儀vario EL III(德國Elementar公司)；SP-20E型全自動點樣儀(上?？普苌萍加邢薰?；WRS-1B數字熔點儀(上海精密科學儀器有限公司)；UV-2700紫外可見分光光度計(日本Shimadzu公司)；Agilent 6520 Q-TOF四極桿聯用飛行時間質譜(美國Agilent科技公司)；INOVA 400 MHz核磁共振波譜儀(美國Varian公司)。

1.2 實驗材料

無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷(分析純，天津市富宇精細化工有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，瑞典Oceanpak試劑公司)；實驗用水為超純水；柱層層析硅膠(100～200目)(青島鼎康硅膠有限公司)；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(Amersham Biosciences公司)；G254薄層硅膠板(青島海洋化工廠)。

實驗所用銀杏葉均購自濟南建聯中藥店，由山東中醫藥大學李佳教授鑒定為銀杏科植物銀杏GinkgobilobaL.的干燥葉。

2 方法與結果

2.1 樣品的制備

2.1.1 樣品的提取

2.1.2 樣品的純化

制得的銀杏內酯C經冷凍干燥得到白色粉末，用4 mL棕色瓶進行分裝，每瓶10 mg(十萬分之一天平稱量)，分裝好的樣品瓶放在4 ℃冰箱中長期保存。

2.2 純度分析方法

2.2.1 高效液相色譜分析

將制備得到的高純度銀杏內酯C溶于甲醇，配制質量濃度為1.5 mg/mL的溶液，使用配有蒸發光檢測器的高效液相色譜儀(HPLC-ELSD)檢測，柱溫設置25 ℃，進樣15 μL，流速為1.0 mL/min。ELSD檢測條件：漂移管溫度105 ℃，氣體流速3.5 L/min，增益值為1。等度色譜條件：色譜柱Nano-micro C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相乙腈(A)-水(B)，0～30 min，32%A；運行時間30 min。梯度色譜條件：色譜柱Nano-micro C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相乙腈(A)-水(B)；梯度：0～30 min，10%～100%A，30～35 min，100%A。

等度色譜分析結果顯示扣除溶劑峰后，樣品純度高于98%；梯度色譜分析結果顯示30～35 min未有明顯雜質峰出現，證明樣品是單一的、純度高于98%的銀杏內酯C。色譜分析結果見圖2。

圖2 銀杏內酯C HPLC圖譜

2.2.2 薄層鑒別

點樣結果表明，樣品在兩個展開體系中均呈現單一棕黃色斑點，Rf值分別為0.50(展開劑I)和0.31(展開劑II)，樣品向上延展的路徑中沒有明顯雜質斑點出現。薄層色譜圖見圖3。

圖3 薄層色譜圖

2.2.3 液質聯用純度分析

色譜柱Nano-micro C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；流動相乙腈(A)-水(B)；梯度洗脫條件0～30 min，10%～100%A；運行時間30 min。質譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，掃描范圍為m/z=100～1000，載氣為高純度氮氣，氣體流速為10 L/min，載氣溫度設置300 ℃，毛細管電壓為4.0 kV。

液質聯用(LC-MS)分析結果表明，正離子和負離子模式下的總離子流圖均未見明顯雜質峰存在?？傠x子流圖見圖4。

圖4 銀杏內酯C總離子流圖

2.2.4 熱重分析

精密稱定銀杏內酯C樣品5.0 mg于熱重分析(TG)用坩堝中，熱重條件初始溫度30.0 ℃，最終溫度600.0 ℃，升溫速率10 ℃/min，流量100 mL/min，氣體為氮氣。

分析結果表明，在溫度28.1～298.5 ℃范圍內，樣品的熱重曲線是一條直線(無明顯變化)，說明銀杏內酯C中基本不含有吸附水和易揮發性物質，熱穩定性良好。當溫度上升至353.4 ℃時，樣品開始分解。TG曲線見圖5。

圖5 銀杏內酯C的TG曲線

2.3 結構確認

銀杏內酯C的結構確認采用4種常見光譜技術(紫外、紅外、質譜和核磁共振技術)。紫外分析法(UV)以甲醇為測試溶劑，掃描范圍為190～640 nm。紅外分析法(IR)使用KBr壓片液膜，掃描范圍為400～6 000 cm-1，采樣速率為80張/s。質譜分析法(MS)使用高分辨質譜，離子源為ESI離子源，載氣為普通氮氣，錐孔氮氣流速10 L/min，載氣溫度350 ℃，毛細管電壓4.0 kV，掃描范圍m/z=100～1 500。核磁共振分析法(NMR)氘代溶劑為DMSO，采集1H譜和13C譜。

圖6 銀杏內酯C的UV譜圖

圖8 銀杏內酯C質譜圖

表1 銀杏內酯C的核磁共振氫譜數據

以上各項光譜數據與文獻[25]報道的銀杏內酯C基本一致，化合物結構鑒定結果為銀杏內酯C。

2.4 均勻性檢驗

按照工作導則中均勻性檢驗的要求，采用隨機抽取、重復測量的方法，從分裝好的樣品中隨機抽取10瓶，按照3種抽取方式(第一次抽樣為1、3、5、7、9、2、4、6、8、10號瓶；第二次抽樣為10、9、8、7、6、5、4、3、2、1號瓶；第三次抽樣為2、4、6、8、10、1、3、5、7、9號瓶)，然后從每瓶中精密稱定1.5 mg樣品3份，用色譜甲醇溶解定容至1 mL容量瓶備用，按照2.2.1項下等度色譜條件對每個樣品進行測定，以樣品峰面積的百分比讀取樣品純度，數據進行均勻性檢驗和方差分析，計算出F值，以確定銀杏內酯C的均勻性是否良好，檢驗結果見表2～3。

表2 均勻性檢驗數據

表3 方差分析數據

(1)

瓶間標準偏差計算：

(2)

u均=Sbb=0.008。

(3)

F值計算：

F=SM間/SM內=2.04。

(4)

以υ1(即組間)=9及υ2(即組內)=20，查詢F界值表，得F0.05(9, 20)=2.94，由于F=2.04<2.94，說明銀杏內酯C的均勻性良好。

2.5 穩定性檢驗

將銀杏內酯C儲存在0～4 ℃，考察樣品2年的穩定性。分5個時間段考察，按2.2.1項下等度條件進行分析，使用峰面積百分比對樣品純度進行計算。每個樣品復測5次，采用t檢驗法對實驗結果進行統計分析，計算穩定性的不確定度[26]，分析結果見表4。

表4 穩定性檢驗試驗結果

斜率計算：

(5)

截距計算：

(6)

直線模型的標準偏差：

(7)

將s=0.017代入公式，斜率相關的不確定度：

(8)

u穩=s(b1)×t=0.001×24=0.024。

(9)

查表得，自由度為(n-2)和95%置信水平(p=0.95)的t0.95,n-2=3.182，由于|b1|

上述計算結果說明，銀杏內酯C樣品在2年內的長期穩定性好。

2.6 定值分析

按照標準樣品工作導則GB/T 15000.3—2008的要求，選取8個實驗室進行定值實驗，隨機抽取24瓶樣品，每個實驗室分配3瓶，每瓶樣品進行2次平行測定。采用高效液相色譜法測定樣品純度，利用各實驗室的純度數據計算平均值和標準偏差，進行定值實驗。銀杏內酯C純度定值結果匯總如表5所示。

表5 協作定值數據匯總

測定結果總平均值的計算：

(10)

各實驗室平均值的標準偏差：

(11)

總平均值標準偏差：

(12)

多家定值的不確定度：

(13)

標準樣品的不確定度由以下3部分組成：(1)均勻性檢驗的不確定度(u均=0.008%)，(2)穩定性檢驗的不確定度(u穩=0.024%)，(3)多家定值的不確定度(u定=0.014%)。需通過這3部分不確定度合成計算得到合成不確定度(u合成)，

u合成=0.03%。

當置信區間95%時，k=2，擴展不確定度uCRM=2u合成=0.06%。

3 結論

本研究嚴格按照GB/T 15000.3—2008的要求，對銀杏內酯C進行了標準品建立所需要的實驗,即均勻性檢驗、穩定性檢驗和定值分析，根據這三個方面進行了不確定度的合成和擴展，獲得了定值純度為(99.85±0.06)%的銀杏內酯C國家標準樣品。該標準樣品可用于銀杏內酯C的含量測定、純度檢測與質量控制，為銀杏、銀杏葉及其他含有銀杏內酯C藥材的成分分析、樣品檢測、科學研究和產品開發提供了技術支撐和溯源保證。本實驗為天然產物研制成國家標準樣品起到了補充效果，填補了銀杏內酯C標準樣品在國內外的空白。