基于外周血循環和糞便樣本進行DNA甲基化技術在結直腸癌早篩中的應用價值探討*

李為杞 李寶龍

1 廣東省廣州市從化區婦幼保健院外科 510900 2 南方醫科大學第五附屬醫院普通外科

結直腸癌在臨床中較常見，而且由于我國居民飲食發生明顯改變，導致其發病率越來越高，存在較高的死亡率。因此，對患者實施早期篩查診斷，可使患者得到早期治療，對提高患者生存率具有重要意義[1]。結直腸癌發病早期，其表觀修飾發生變化，可使基因突變節奏明顯增快，因而對表觀修復進行檢測，可使結直腸癌得到一定篩查[2]。DNA甲基化可使基因表達得到有效調控，健康機體中，全基因組往往呈現為低甲基化表型，當機體出現異常變化時，往往都按照甲基化模式酶發生明顯改變，尤其是癌變后，會使此酶出現明顯調節時空現象，從而使之基因表達出現異常[3]。本研究選取結直腸癌患者40例，探討外周血循環和糞便樣本進行DNA甲基化技術的應用效果，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年4月—2020年5月20例正常人群，設定為健康組。納入標準：患者健康體檢未出現腫瘤癥狀；均知情同意。排除標準：精神分裂癥；妊娠期、哺乳期。其中男12例，女8例；年齡35～65歲，平均年齡(52.95±2.58)歲。并選取同時期腺瘤患者20例，設定為腺瘤組，納入標準：均確診為腺瘤病變；患者均知情同意。排除標準：其他腫瘤病變；妊娠期、哺乳期；嚴重精神障礙。其中男11例，女9例；年齡36～66歲，平均年齡(53.02±2.60)歲。選取同時期結直腸癌患者40例，納入標準：均確診為結直腸癌；患者知情同意。排除標準：其他腫瘤病史;接受放射療法、化學療法;腹部外科手術史;妊娠期、哺乳期等。根據病情程度分為早中期結直腸癌組(n=20)、晚期結直腸癌組(n=20)，早中期結直腸癌組中男11例，女9例；年齡37～66歲，平均年齡(52.98±2.58)歲；晚期結直腸癌組中男11例，女9例；年齡37～66歲，平均年齡(52.98±2.58)歲。四組一般資料比較，無統計學差異(P>0.05)。

1.2 方法 外周血檢測：抽取10ml外周靜脈血，放置到EDTA抗凝真空采血管內,經離心處理12min后，分離血漿3.5ml,放置到-20℃環境下。采用PCR熒光探針法試劑盒，按照要求操作，對DNA進行提取，實施亞硫酸鹽轉化，予以Bis-DNA結合，再予以洗脫，通過PCR反應，判定SEPT9、SFRP2陽性情況。糞便樣本檢測：在清晨新鮮糞便樣本中提取DNA，取200mg糞便標本，根據糞便基因組DNA提取試劑盒進行操作，然后按照DNA清潔試劑盒步驟完成劑盒操作提取，通過分光光度計實施DNA純度檢測，通過電泳、凝膠成像系統確定DNA是否完整，若不完整需再次提取。若DNA完整，可實施重亞硫酸氫鹽處理，采用PCR擴增，予以瓊脂糖凝膠電泳分析，使之保持甲基化狀態，對SEPT9、SFRP2陽性進行判斷。

1.3 觀察指標 比較四組單獨外周血、糞便樣本SEPT9、SFRP2檢出率，且比較四組外周血聯合糞便樣本SEPT9、SFRP2檢出率。

2 結果

2.1 四組外周血SEPT9、SFRP2檢出率比較 早中期結直腸癌組、晚期結直腸癌組外周血SEPT9、SFRP2檢出率均明顯高于健康組、腺瘤組，且晚期結直腸癌組外周血SEPT9、SFRP2檢出率高于早中期結直腸癌組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 四組外周血SEPT9、SFRP2檢出率比較[n(%)]

2.2 四組糞便樣本中SEPT9、SFRP2檢出率比較 早中期結直腸癌組、晚期結直腸癌組糞便樣本中SEPT9、SFRP2檢出率均明顯高于健康組、腺瘤組，且晚期結直腸癌組糞便樣本中SEPT9、SFRP2檢出率高于早中期結直腸癌組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 四組糞便樣本中SEPT9、SFRP2檢出率比較[n(%)]

2.3 四組外周血聯合糞便SEPT9、SFRP2檢出率比較 早中期結直腸癌組、晚期結直腸癌組外周血聯合糞便SEPT9、SFRP2檢出率均明顯高于健康組、腺瘤組，且晚期結直腸癌組外周血聯合糞便SEPT9、SFRP2檢出率高于早中期結直腸癌組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。且與表1、表2相比較，外周血聯合糞便SEPT9、SFRP2檢出率高于單獨使用外周血、糞便檢測結果，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 四組外周血聯合糞便SEPT9、SFRP2檢出率比較[n(%)]

3 討論

表觀遺傳學在廣義上指基因DNA序列雖未出現變化，但表達出現可遺傳改善，由RNA、DNA、蛋白質等對基因表達進行調控，由此使基因表型出現變化[4]。因此，對癌癥相關基因表達進行調控可對癌癥進行合理控制[5]。DNA甲基化指通過DNA甲基轉移酶作用,胞嘧啶第5位碳原子加一個甲基基團,可使染色質空間構象發生變化,對DNA轉錄、表達具有明顯抑制作用,利于其長時間保持靜默。當抑癌基因出現異常甲基化,正常轉錄、翻譯受明顯抑制,無法形成抑癌蛋白,極易引發腫瘤疾病[6]。因此采用DNA甲基化對癌癥進行早篩具有重要意義。

經研究可知，早中期結直腸癌組、晚期結直腸癌組外周血SEPT9、SFRP2檢出率均明顯高于健康組、腺瘤組，且晚期結直腸癌組外周血SEPT9、SFRP2檢出率高于早中期結直腸癌組；早中期結直腸癌組、晚期結直腸癌組糞便樣本中SEPT9、SFRP2檢出率均明顯高于健康組、腺瘤組，且晚期結直腸癌組糞便樣本中SEPT9、SFRP2檢出率高于早中期結直腸癌組；早中期結直腸癌組、晚期結直腸癌組外周血聯合糞便SEPT9、SFRP2檢出率均明顯高于健康組、腺瘤組，且晚期結直腸癌組外周血聯合糞便SEPT9、SFRP2檢出率高于早中期結直腸癌組；外周血聯合糞便SEPT9、SFRP2檢出率高于單獨使用外周血、糞便檢測結果(P<0.05)。因此可知，采用外周血循環和糞便樣本實施DNA甲基化技術，對結直腸癌具有較高的篩查價值。機體中腸道保持堿性環境，可使DNA得以保存，并有效提取[7]。若機體出現腫瘤,往往導致糞便內出現腫瘤脫落癌細胞、游離腫瘤DNA。通過對糞便標本應用基因甲基化技術，可使腫瘤得到有效篩查[8]。外周血內含有大量游離腫瘤DNA，通過對其進行DNA甲基化技術檢測，可對結直腸癌進行評估。SFRP2是一種Wnt信號通路拮抗物，可與Writ信號蛋白質產生作用，由此使Wnt信號受到明顯阻礙，是一種腫瘤抑制基因，可對Wnt信號進行有效調控，對結直腸癌發生發展具有明顯參與作用。SEPT9在結直腸癌疾病中往往出現甲基化，是診斷結直腸癌的重要生物標志物[9]。SFRP2、SEPT9在結直腸癌均具有較高檢測價值，通過外周血循環和糞便樣本的測定，可有效評估癌變情況。

總之，外周血循環和糞便樣本實施DNA甲基化技術對結直腸癌早篩具有重要作用，可推廣使用。