高癌家系氣虛質鼻咽癌患者鼻咽組織標本RhoGDIβ的表達水平及其臨床病理意義*

劉 湘 肖紅云 陳舒華

1 廣東省佛山市第二人民醫院 528000； 2 邵陽市中心醫院

鼻咽癌是指惡性腫瘤位置位于鼻咽腔頂部或側壁的疾病類型，惡性腫瘤發病類型統計中，在我國該類癌癥屬于高發性癌癥類型[1]。臨床治療過程中發現，由于其病理學特征及疾病位置的特殊性，放療是首選的治療辦法。但是在治療過程中的臨床觀測情況了解可知，單純的放射治療對早期鼻咽癌有良好的治療效果，但對病情發展到一定程度的鼻咽癌臨床療效并不理想，而且會帶來嚴重的放射治療損傷作用[2]。研究發現鼻咽癌高癌家系與遺傳存在密切關聯，且高癌家系鼻咽癌患者多表現為氣虛質、復合質和失調熱質，而散發性鼻咽癌表現為復合質和氣虛質[3]。有研究發現Annexin A7和RhoGDIβ的表達與多種腫瘤的發生和發展有明顯關聯[4]。中醫中鼻咽癌屬于“氣虛染毒”，此學說已在動物實驗中驗證，但臨床實驗報道較少，因此本文對高癌家系氣虛質鼻咽癌組織中的RhoGDIβ進行鑒定，觀察其特定病理意義及蛋白質組分RhoGDIβ的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗標本 選取2019年11月—2020年11月我院耳鼻咽喉科高癌家系氣虛質鼻咽癌組織標本、散發氣虛質鼻咽癌組織標本和正常組織標本，每組標本各收集6例。納入者資料完整，且高癌家系中確定兩代人中有3個以上家族成員患癌癥，2個以上患鼻咽癌。納入者均未接受過放化療和均無淋巴結轉移，且未分化非角化性鱗狀細胞癌；依據2008鼻咽癌分期標準確診[5]。初診鼻咽癌患者年齡在18～69歲，無嚴重系統性疾病和傳染病，精神意識正常，非月經期，排除哺乳期和孕期者。鼻咽組織取出放入-80℃冰箱保存。

1.2 實驗方法 應用oligo7.0軟件和參照相關文獻進行設計引物，采用BLAST檢索確認引物的特異性，并使用BioEdit軟件進行序列分析比較，RhoGDIβ引物序列：F:5’-GACTTCCTTCCTGTTCTAACTGC-3’，R:5’-CAGTGCTTCACGTCTCTGTCC-3’，產物長度82bp；β-actin引物序列：F:5’-ACCGGAACGGAGCTATGAAC-3’，R:5’-ATCCCACTGGACTCAATGCC-3’，產物長度116bp。

1.3 檢測方法 實驗使用的離心管均經無菌無酶處理，勻漿器物品使用0.1%的DEPC溶液進行浸泡37℃過夜，并于126℃下滅菌30min，總RNA提取根據RNeasy MiniKit試劑盒說明嚴格操作。逆轉錄CADNA：參照Thermo Scientific RevertAid Firt Stran cDNA Synthesis Kit試劑盒進行嚴格操作。將試劑盒中各組組分混勻離心，離心后放于冰上，在放置于冰上無菌無核核酸酶的PCR管中。PCR反應液配置參照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明進行操作，反應體系為25μl，操作時均在冰上進行充分混勻試劑。Westernm blotting法：將總蛋白提取，每組稱重100mg，加入預冷蛋白裂解液1ml，放于冰上玻璃勻漿器中勻漿至透明無顆粒后分別轉移至預冷的1.5ml的EP管，4℃，10 000r/min離心5min，轉移至上清液并重新預冷至1.5ml EP管中，放于-80℃下保存。BCA法蛋白：根據BCA試劑盒說明操作，并采用蛋白標準曲線檢測蛋白濃度。Westernm blotting蛋白免疫印跡結果分析采用Alpha View SA凝膠圖像進行分析，并分析其光密度值，觀察蛋白光度值與內參光度值的比值，并判斷目的蛋白的含量。

2 結果

2.1 RhoGDIβ Real Time PCR檢測結果 Real Time PCR分析表達使用2-ΔΔCt值相對量法推算樣本中RhoGDIβcDNAd的模板起始量，內參基因使用β-actin；將正常鼻咽組織設為正常組，觀察高癌家系和散發氣虛質鼻咽癌組中RhoGDIβ的基因表達情況。結果顯示高癌家系鼻咽癌組中的RhoGDIβ表達量是正常組的0.88倍和3.01倍，而散發性鼻咽癌組的RhoGDIβ表達無明顯變化。采用單因素方差分析正常組RhoGDIβ基因表達與散發性鼻咽癌組比較差異無統計學意義(P>0.05)；正常組與高癌家系鼻咽癌組比較差異有統計學意義(P<0.01)；高癌家系鼻咽癌組與散發性鼻咽癌組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表1～2、圖1～2。

表1 觀察3組RhoGDIβ mRNA的表達差異

圖1 RhoGDIβ mRNA在正常組、散發性鼻咽癌組及高癌家系鼻咽癌組中的表達情況

表2 觀察3組RhoGDIβ mRNA相對表達

圖2 RhoGDIβ mRNA在正常組、散發性鼻咽癌組及高癌家系鼻咽癌組中的相對表達

2.2 Western blotting檢測結果 采用兔抗人RhoGDIβ抗體作為1抗，β-actin作為內參蛋白，對3組中的RhoGDIβ蛋白表達進行檢測，檢測顯示內參蛋白β-actin在3組鼻咽組織中均有表達(P>0.05)，見圖3。RhoGDIβ蛋白與β-actin的OD比較發現，正常組RhoGDIβ蛋白相對表達量為1.01±0.28，散發性鼻咽癌組為0.29±0.18，高癌家系鼻咽癌組為3.15±1.13，3組蛋白表達結果經方差分析比較差異具有統計學意義(F=18.110，P=0.000<0.01)。組間兩兩比較顯示，正常組高于散發性鼻咽癌組(P=0.011)，但低于高癌家系鼻咽癌組(P=0.015)散發性鼻咽癌組低于高癌家系鼻咽癌組(P=0.006)。即高癌家系鼻咽癌組織中表達明顯上調，而散發性鼻咽癌組則下調。見圖4。

圖3 RhoGDIβ蛋白Western blotting蛋白免疫印跡結果

圖4 RhoGDIβ蛋白在正常組、散發性鼻咽癌組及高癌家系鼻咽癌組中的相對表達

3 討論

研究發現早期采用蛋白組學鑒定高癌家系鼻咽癌組織中的RhoGDIβ蛋白表達較其他蛋白質表達更加明顯，但蛋白組學法自身存在明顯不足[6-7]。有研究發現氣虛體質與鼻咽癌的發生和發展存在明顯關聯，且RhoGDIβ與癌細胞的生長、分化、發生、發展和轉移等存在密切關聯[8-9]。RhoGDIβ可能屬于癌基因的產物，可能受抑癌基因和癌基因的調控，或通過某種方式而激活癌基因[10-11]。目前關于RhoGDIβ蛋白表達的情況多于細胞轉移、淋巴組織的分布和細胞凋亡等有關，且實驗證實RhoGDI2可持續性激活Racl/cdc42GTPases，從而起到促進細胞轉移[12-13]。研究顯示RhoGDIβ蛋白可促進胃癌細胞的生長和發展，且RhoGDI2過表達癌細胞中的B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)的基因明顯上調，Bcl-2在RhoGDI2過表達中對順鉑的耐藥性起到了中介作用[14-15]。RhoGDIβ蛋白不僅在胃癌中有表達，在結直腸癌、膀胱癌和乳腺癌中均有表達。

本文通過PCR檢測RhoGDIβ在散發氣虛質鼻咽癌和高癌家系氣虛質鼻咽癌組織中的表達情況，顯示RhoGDIβRNA在高癌家系組中的表達明顯較正常組和散發性鼻咽癌組上調，而正常組與散發性鼻咽癌組經比較差異無統計學意義(P>0.05)，本研究認為可能與散發性鼻咽癌組中的RhoGDIβ表達對人體無影響，且推測散發性鼻咽癌組中的RhoGDIβ受Etsl的調節，從而表現出了雙重作用，最終導致RhoGDIβ表達與正常組無明顯差異。本文發現，RhoGDIβ RNA在高癌家系氣虛質鼻咽癌組織中的表達明顯上調，而根據相關文獻研究發現高癌家系氣虛質鼻咽癌組織中可能存在遺傳缺陷，加上氣虛可能對DNA有明顯影響，導致損傷修復基因發生變化。Western blotting法檢測發現RhoGDIβ可能與高癌家系氣虛質鼻咽癌患者存在明顯正相關性，發現RhoGDI2的高表達促進了高癌家系氣虛質鼻咽癌患者的發生和發展。研究發現RhoGDI2蛋白促進了CRC細胞增殖和轉移，部分通過信號通路激活了PI3K/AKt。研究提示檢測鼻咽癌組織中RhoGDIβ的表達情況可能對早期診斷和分子靶向治療起到了重要意義。

綜上所述，實驗證實RhoGDIβ屬于本課題早期鑒定出的表達蛋白，在高癌家系氣虛鼻咽癌患者中RhoGDIβ存在明顯高表達作用，可作為早期診斷和篩查的重要標記物。