毛秀才INW-Ⅰ對MC3T3-E1細(xì)胞增殖和分化的影響及分子機(jī)制研究

李 興，吳陳朋，劉 玉，曾憲靈，陳端忠，彭小珍★

（1. 湖南醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生與檢驗醫(yī)學(xué)院，湖南 懷化 418000 ；2. 湖南醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖南 懷化 418000）

毛秀才又名顯脈旋覆花Inula nervosa Wall.，為菊科旋覆花屬植物，主要產(chǎn)于我國四川西部、云南北部至南部、貴州西部、廣西西部及湖南懷化地區(qū)[1-2]。侗藥記載，毛秀才具有祛風(fēng)寒、通經(jīng)絡(luò)、消積止痛等功效，尤其在治療跌打損傷、骨折方面有很好的療效，且其無毒副作用[3]。但目前關(guān)于毛秀才治療骨折作用機(jī)制及分子機(jī)制的研究較少。本研究以小鼠顱頂前成骨細(xì)胞亞克隆14（MC3T3-E1 subclone 14）為細(xì)胞模型，檢測毛秀才二氯甲烷部位（INW- Ⅰ）對MC3T3-E1 細(xì)胞活性的影響，同時驗證毛秀才INW- Ⅰ對該細(xì)胞細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（BMP-9）mRNA 及蛋白表達(dá)的影響，為毛秀才的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

毛秀才（ 采集于湖南懷化雪峰山）；MC3T3-E1 細(xì)胞（ 購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；胎牛血清（FBS）（購于美國HyClone 公司）；高糖DMEM 培養(yǎng)基（購于美國Gibco 公司）；CCK-8 試劑盒（購于中國Procell 公司）；ERKI/2、BMP-9 抗體和二抗（購于英國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 毛秀才INW- Ⅰ的提取 用95% 的乙醇提取獲得毛秀才總浸膏，依次用石油醚、二氯甲烷、正丁醇、乙酸乙酯對毛秀才總浸膏進(jìn)行萃取，分別獲得毛秀才石油醚部位、INW- Ⅰ、正丁醇部位、乙酸乙酯部位和水部位。將毛秀才INW- Ⅰ凍干后獲得INW- Ⅰ粉末，置于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MC3T3-E1 細(xì)胞的培養(yǎng) 培養(yǎng)基為10% 的FBS+ 高糖DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱。

1.2.3 MC3T3-E1 細(xì)胞活性的檢測 采用CCK-8試劑盒檢測MC3T3-E1 細(xì)胞的活性，將細(xì)胞接種于96 孔板內(nèi)（5000 個細(xì)胞/ 孔），建立對照組和INW- Ⅰ藥物組。INW- Ⅰ藥物濃度為：100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL、600 μg/mL。孵育24 h 后，每孔加入10 μL 的CCK-8 試劑，1 h 后用酶標(biāo)儀檢測（檢測波長為450 nm）其光密度（OD）值，并檢測每組細(xì)胞的相對活性。根據(jù)檢測結(jié)果，確定500 μg/mL 為最佳濃度。將MC3T3-E1 細(xì)胞分為對照組、500 μg/mL INW- Ⅰ組、ERK1/2 抑制劑U0126 組和BMP-9 抑制劑Noggin 組。檢測各組MC3T3-E1 細(xì)胞的活性，具體的檢測方法同上。

1.2.4 MC3T3-E1 細(xì)胞mRNA 表達(dá)水平的檢測提取MC3T3-E1 細(xì)胞的RNA，操作步驟是：吸走培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS 清洗2 次，在對照組、500 μg/mL INW- Ⅰ組、ERK1/2 抑制劑U0126組、BMP-9 抑制劑Noggin 組MC3T3-E1 細(xì)胞培養(yǎng)皿中分別加入1 mL 的Trizol，靜置10 min 后加入200 μL 的氯仿，上下顛倒后靜置5 min。以12 000 rpm 的轉(zhuǎn)速進(jìn)行15 min 的離心處理，取上清液。將上清液滴入另一支新的EP 管中，加入200 μL 的異丙醇，靜置10 min 后以12 000 rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行15 min 的離心處理。棄去上清液，加入75% 的乙醇，以12 000 rpm 的轉(zhuǎn)速進(jìn)行10 min的離心處理。棄去上清液，用濾紙吸走杯壁上的液體，加入20 μL 的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解，測定RNA 的濃度。逆轉(zhuǎn)錄：具體的操作方法參照試劑盒的說明書。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）：反應(yīng)所需的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體的引物序列見表1。反應(yīng)體系及操作步驟參照試劑盒的說明書。

表1 引物序列

1.2.5 MC3T3-E1 細(xì)胞中p-ERK1/2、BMP-9 蛋白表達(dá)水平的檢測 將對照組、500 μg/mL INW- Ⅰ組、ERK1/2 抑制劑U0126 組、BMP-9 抑制劑Noggin 組MC3T3-E1 細(xì)胞經(jīng)RIPA 裂解液裂解后，以12 000 rpm 的轉(zhuǎn)速在4 ℃下進(jìn)行30 min 的離心處理，取上清液，采用蛋白質(zhì)定量（BCA）法測定上清液中p-ERK1/2、BMP-9 蛋白的濃度。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法分離上清液中的p-ERK1/2、BMP-9 蛋白，分別孵育一 抗p-ERK1/2（1:1000）、BMP-9（1:1000）、Tubulin（1:1000）和二抗。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察不同濃度的毛秀才INW- Ⅰ對MC3T3-E1 細(xì)胞活性的影響。觀察毛秀才INW-Ⅰ、ERK1/2 抑制劑U0126 和BMP-9 抑制劑Noggin 對MC3T3-E1 細(xì)胞活性的影響。觀察對照組、500 μg/mL INW- Ⅰ組、ERK1/2 抑制劑U0126 組、BMP-9 抑制劑Noggin 組MC3T3-E1細(xì)胞中ERK1/2、BMP-9 mRNA 及p-ERK1/2、BMP-9 蛋白的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 17.0 軟件處理本研究中的數(shù)據(jù)，計量資料用±s表示，組間比較用t檢驗或單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的毛秀才INW-Ⅰ對MC3T3-E1細(xì)胞活性的影響

各組（對照組和不同濃度的INW- Ⅰ組）MC3T3-E1 細(xì)胞在培養(yǎng)24 h 后，采用CCK-8 試劑盒檢測其OD 值，結(jié)果顯示，不同濃度INW- Ⅰ組MC3T3-E1 細(xì)胞的OD 值均高于對照組MC3T3-E1 細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在濃度為100 ～500 μg/mL 的范圍內(nèi)，毛秀才INW- Ⅰ的濃度越高M(jìn)C3T3-E1 細(xì)胞的OD 值越大，組間相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖1。這說明，濃度為100 ～600 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ均能提高M(jìn)C3T3-E1 細(xì)胞的活性，促進(jìn)其增殖，且500 μg/mL 這一濃度是促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞增殖最適宜的濃度。

圖1 不同濃度毛秀才INW-Ⅰ對MC3T3-E1 細(xì)胞活性的影響

2.2 500μg/mLINW-Ⅰ、U0126 及Noggin對MC3T3-E1 細(xì)胞活性的影響

各組（ 對照組、500 μg/mL INW- Ⅰ組、ERK1/2 抑制劑U0126 組、BMP-9 抑制劑Noggin組）MC3T3-E1 細(xì)胞在培養(yǎng)24 h 后，采用CCK-8試劑盒檢測其OD 值，結(jié)果顯示，500 μg/mL INW- Ⅰ組MC3T3-E1 細(xì)胞的活性顯著高于對照組，ERK1/2 抑制劑U0126 組、BMP-9 抑制劑Noggin 組MC3T3-E1 細(xì)胞的活性均低于對照組， 其中BMP-9 抑制劑Noggin 組MC3T3-E1細(xì)胞的活性最低，組間相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖2。這說明，500 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ可顯著提高M(jìn)C3T3-E1 細(xì)胞的活性，BMP-9 抑制劑Noggin 和ERK1/2 抑制劑U0126 均可抑制MC3T3-E1 細(xì)胞的活性，且BMP-9 抑制劑Noggin 對MC3T3-E1 細(xì)胞活性的抑制效果最強(qiáng)。

圖2 500 μg/mL INW-Ⅰ、U0126 及Noggin 對MC3T3-E1 細(xì)胞活性的影響

2.3 各組MC3T3-E1 細(xì)胞中ERK1/2 和BMP-9mRNA 的表達(dá)

各組（ 對照組、500 μg/mL INW- Ⅰ組、ERK1/2 抑制劑U0126 組、BMP-9 抑制劑Noggin組）MC3T3-E1 細(xì)胞在培養(yǎng)24 h 后，分別觀察其ERK1/2 和BMP-9 mRNA 的表達(dá)水平， 結(jié)果顯示，500 μg/mL INW- Ⅰ組MC3T3-E1 細(xì)胞中ERK1/2 mRNA 的表達(dá)水平高于對照組，ERK1/2 抑制劑U0126 組MC3T3-E1 細(xì)胞中ERK1/2 mRNA 的表達(dá)水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。詳見圖3A；500 μg/mL INW- Ⅰ組MC3T3-E1 細(xì)胞中BMP-9 mRNA 的表達(dá)水平高于對照組，BMP-9 抑制劑Noggin 組MC3T3-E1 細(xì)胞中BMP-9 mRNA 的表達(dá)水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。詳見圖3B。這說明，500 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ對MC3T3-E1 細(xì)胞中ERK1/2 和BMP-9 mRNA 的表達(dá)均有顯著的促進(jìn)作用，ERK1/2 抑制劑U0126對MC3T3-E1 細(xì)胞中ERK1/2 mRNA 的表達(dá)具有顯著的抑制作用，BMP-9 抑制劑Noggin 對MC3T3-E1 細(xì)胞中BMP-9 mRNA 的表達(dá)具有顯著的抑制作用。

圖3 500 μg/mL INW-Ⅰ、U0126 及Noggin 對MC3T3-E1 細(xì)胞中ERK1/2、BMP-9 mRNA 表達(dá)的影響

2.4 各組MC3T3-E1 細(xì)胞中p-ERK1/2 和BMP-9 蛋白的表達(dá)

各 組（ 對 照 組、500 μg/mL INW- Ⅰ組、ERK1/2 抑制劑U0126 組、BMP-9 抑制劑Noggin 組）MC3T3-E1 細(xì)胞在培養(yǎng)24 h 后，對其p-ERK1/2 和BMP-9 蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，500 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ可促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞中p-ERK1/2 和BMP-9 蛋白的表達(dá)，而ERK1/2 抑制劑U0126 可抑制MC3T3-E1細(xì)胞中p-ERK1/2 蛋白的表達(dá)，BMP-9 抑制劑Noggin 可抑制MC3T3-E1 細(xì)胞中BMP-9 蛋白的表達(dá)。詳見圖4A、4B。

圖4 500 μg/mL INW-Ⅰ、U0126、Noggin 對MC3T3-E1 細(xì)胞中p-ERK1/2和BMP-9 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

骨折的愈合是一個極其復(fù)雜的組織學(xué)、生物學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、生物力學(xué)修復(fù)的過程。受諸多因素的影響，骨折患者可發(fā)生骨折延遲愈合或不愈合[4]。據(jù)不完全統(tǒng)計，有5% ～10% 的骨折患者會由于各種原因而發(fā)生骨折延遲愈合或不愈合[5]。研究指出，術(shù)后骨折區(qū)域血液循環(huán)不暢引發(fā)的局部血腫、水腫是導(dǎo)致骨折延遲愈合或不愈合的主要原因[6]。因此，尋找一種有效促進(jìn)骨折愈合的藥物十分重要。本研究的結(jié)果顯示，100 ～500 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ均能有效提高M(jìn)C3T3-E1 細(xì)胞的活性，且隨著毛秀才INW- Ⅰ濃度的增加，MC3T3-E1 細(xì)胞的活性越高。這說明，毛秀才INW- Ⅰ能提高成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)其增殖。EKR 信號通路是骨細(xì)胞增殖和分化的重要通路[7]。臨床上普遍認(rèn)為BMP-2、BMP-4、BMP-7 和BMP-9 具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)成骨能力，其中BMP-9 是目前發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)成骨能力最強(qiáng)的成骨因子。本研究中我們檢測了MC3T3-E1 細(xì)胞中ERK1/2 和BMP-9 mRNA、蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)500 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ對MC3T3-E1細(xì)胞中ERK1/2、BMP-9 mRNA 及p-ERK1/2、BMP-9 蛋白的表達(dá)均有促進(jìn)作用。

綜上所述，毛秀才INW-Ⅰ可提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞的活性，促進(jìn)其增殖。毛秀才INW-Ⅰ可能是通過上調(diào)MC3T3-E1 細(xì)胞中p-ERK1/2 和BMP-9 的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化。