蘋果酸—乳酸發酵對刺梨酒香氣的影響

郭志君 楊 磊 駱紅霞 周模美 房玉林

(1. 茅臺學院，貴州 仁懷 564500；2. 西北農林科技大學，陜西 咸陽 712100)

刺梨(RosaroxburghiiTratt)為薔薇科多年生落葉灌木植物，具有防風固沙生態保護作用，同時含有較高的抗壞血酸、酚類等生物活性成分[1]，已成為貴州省鄉村振興特色產業之一，截至2020年，貴州省刺梨鮮果產量超10萬t[2]。刺梨加工產品種類豐富，尤其刺梨酒一直是研發熱點[3]，但由于刺梨果實含酸量高，發酵酒口感酸澀粗糙、風味欠佳。國內外學者在改善刺梨發酵酒風味方面進行了相關研究[4-6]，主要基于不同澄清材料選擇、酵母菌種篩選、發酵工藝參數優化、水果復配等方法平衡口感。

蘋果酸—乳酸發酵(malolactic fermentation，MLF)是一種有效的生物降酸方法，在乳酸菌的作用下將高酸感的蘋果酸轉化為低酸感的乳酸，增加酒體的圓潤度，同時產生其他香氣風味物質[7]，被廣泛用于葡萄酒發酵過程以及酸度較高果汁的降酸處理[8]，MLF對野生獼猴桃[9]、藍莓[10]、櫻桃[11]、桑葚[12]等果酒品質的影響已有報道，目前尚未有對刺梨酒進行MLF的相關報道。

有機酸種類含量、揮發性成分共同影響刺梨酒的口感風格和典型性，研究擬選用貴州省畢節刺梨順序進行酒精發酵(AF)和MLF，以單一酒精發酵為對照，采用離子色譜法和頂空固相微萃取—氣相色譜質譜法(HS-SPME/GC-MS)對刺梨酒中的有機酸和揮發性成分進行定性定量分析，結合香氣活度值(OAV)和感官分析，探究MLF對刺梨酒的降酸效果、揮發性成分和口感的影響，以期達到降酸和改善刺梨酒風味的目的，為刺梨酒開發應用提供一定理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮貴州省畢節刺梨、蔗糖：市售；

偏重亞硫酸鉀：意大利DAL CIN公司；

澄清果膠酶RCL：德國AB Enzymes公司；

釀酒酵母ST：法國Laffort公司；

酒類酒球菌(Oenococcus oeni)Viniflora CH35：丹麥Chr.hansen公司；

有機酸標準品(純度>99%)、4-辛醇：北京索萊寶科技有限公司；

乙醇、碳酸氫鈉、2,6-二氯靛酚、偏磷酸：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取纖維頭：西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

離子色譜儀：Dionex ICS-1500型，美國Thermo Scientific公司；

陰離子分離柱(4 mm×250 mm)：IonPACAS11-HC型，美國Thermo Scientific公司；

保護柱(4 mm×50 mm)：IonPAC?AG11-HC型，美國Thermo Scientific公司；

氣相色譜—質譜聯用儀：7980A-5977B型，美國Agilent公司；

多功能樣品前處理平臺：MPS XT型，德國Gerstel公司。

1.3 方法

1.3.1 刺梨酒發酵工藝

原料挑選→破碎壓榨→刺梨汁澄清→成分調整→酒精發酵→MLF→終止發酵→酒樣

操作要點：挑選成熟的無霉變鮮刺梨果進行清洗、壓榨取汁，過程中分次加入100 mg/L偏重亞硫酸鉀，30 min后加入果膠酶室溫放置3 h，6 ℃低溫澄清24 h取清汁并用蔗糖調整其總糖度為150 g/L，回溫后接種已活化的酵母200 mg/L進行酒精發酵，控溫18～20 ℃，總糖小于4 g/L時發酵結束，1/2酒樣添加偏重亞硫酸鉀120 mg/L，4 ℃保存(對照酒樣)；其余酒樣添加酒類酒球菌1 g/L繼續進行MLF，控溫18～20 ℃，發酵結束時添加偏重亞硫酸鉀120 mg/L，4 ℃保存待測。

1.3.2 刺梨酒有機酸含量測定 草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸采用離子色譜法，參考SN/T 4675.5—2016《出口葡萄酒中有機酸的測定 離子色譜法》稍做修改，配制7種有機酸混合標準溶液，混合標準溶液中乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸的質量濃度分別為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/L，蘋果酸、酒石酸、草酸的質量濃度分別為2.0，5.0，10.0，20.0，40.0 mg/L，酒樣稀釋后經0.45 μm水系濾膜過濾待測。柱溫箱溫度35 ℃，柱溫30 ℃，KOH淋洗液，多級梯度淋洗，淋洗液流速0.8 mL/min，抑制電流150 mA，進樣量25 μL。保留時間定性，外標法定量。

抗壞血酸采用2,6-二氯靛酚滴定法，按GB 5009.86—2016《食品安全國家標準 食品中抗壞血酸的測定》執行。

1.3.3 刺梨酒中揮發性成分測定 參考郭志君等[13]的方法。

1.3.4 香氣活度值(OAV)計算 采用揮發性物質的含量與其閾值之比。閾值受溶劑及分析方法影響較大，目前并沒有刺梨酒中香氣閾值的文獻報道，參考與刺梨酒酒精度相近溶液中的閾值[14]，首選低醇(9%～14%)酸性水溶液、其次為葡萄酒和水。一般認為，OAV≥1.0的化合物單獨對酒的香氣有貢獻，0.1≤OAV<1.0對香氣有重要修飾作用[15]。

1.3.5 感官評價 采用QDA法[16]，由10位專業感官品評員(5名男性和5名女性)對刺梨酒MLF前后的樣品進行感官評價，獲得評價的主要感官描述詞，并對樣本進行5點標度法打分，取平均分值作感官評定雷達圖。

1.4 數據分析

采用Excel和SPSS 21.0對試驗數據進行處理，并進行差異顯著性分析，以P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 MLF對刺梨酒有機酸含量的影響

采用離子色譜法對刺梨酒中有機酸進行定性定量分析，測得刺梨酒中主要8種有機酸，分別為草酸、酒石酸、抗壞血酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸，雖然抗壞血酸不含自由羥基屬于己糖內酯化合物，但因其分子可游離出H+具有有機酸的性質，因此歸為一類分析。由表1可知，經MLF刺梨酒總有機酸含量降低了1.40 g/L；蘋果酸含量由6.21 g/L降至0.88 g/L，顯著降低85.83%；而乳酸含量由0.55 g/L增至4.49 g/L，顯著升高87.75%，變化趨勢與葡萄酒中的研究結果近似[17]。具有生青味、酸澀的蘋果酸經MLF脫縮轉化為柔和、有乳香味的乳酸，有利于改善刺梨酒酸澀生青的口感。刺梨酒經過MLF乙酸含量升高0.11 g/L，部分乙酸為乳酸菌代謝檸檬酸等物質產生，一定程度上有利于形成更多的酯類香氣物質，豐富刺梨酒的果香，但含量過高則產生酸敗風味。MLF對其他有機酸含量無顯著影響，檢測到刺梨酒中的抗壞血酸含量僅為0.34 g/L，遠低于果實中的含量[18]，但高于彭小東等[19]采用HPLC法測定的刺梨酒中0.077 g/L的抗壞血酸含量，主要因為抗壞血酸化學性質不穩定、易被氧化，在果酒釀造過程中極易損失，貯藏條件和檢測方法對刺梨酒中抗壞血酸的含量有影響。

表1 MLF對刺梨酒有機酸含量的影響?Table 1 Effect of MLF on organic acid of Rosa roxburghii Tratt wine g/L

2.2 MLF對刺梨酒揮發性成分的影響

2.2.1 MLF對揮發性成分種類和含量的影響 采用HS-SPME/GC-MS技術檢測MLF后的刺梨酒(AF-MLF)的揮發性成分種類和含量，共鑒定出114種揮發性成分，其中包括酯類48種、醇類26種、酸類13種、醛酮類10種、烷烴類10種、其他化合物7種，結果見表2。

表2 MLF對刺梨酒揮發性成分及香氣活度值的影響?Table 2 Effect of MLF on volatile components and odor activity value of Rosa roxburghii Tratt wine

續表2

續表2

續表2

酯類物質是刺梨酒中種類最多、含量最高的揮發性成分，占總揮發性物質含量的70%以上。酯類多數具有水果香和花香[24]，并且閾值較低，是刺梨酒整體香氣的重要組成部分。MLF后共檢出48種酯類，總含量為12 011.60 μg/L，比對照提高10.81%，主要包括辛酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、(E)-3-己烯-1-醇乙酸酯、乙酸葉醇酯、乙酸苯乙酯、乙酸己酯、反式-肉桂酸乙酯等。與對照相比，僅在MLF后的酒樣中檢測到的酯類有11種，包括乙酸葉醇酯、DL-3-乙酰氧基丁酸乙酯、3-己烯酸乙酯、辛酸辛酯、肉桂酸異戊酯、乳酸異戊酯等，主要表現出甜香、奶油香、椰子香等；經過MLF刺梨酒中的(E)-3-己烯-1-醇乙酸酯、乙酸己酯含量明顯降低，這些物質具有植物、青果味，而具有香蕉、菠蘿成熟果香的辛酸乙醇含量則升高14.00%。說明MLF可提高刺梨酒中酯類物質的種類和含量，總體向果香和奶油香發展，與葡萄酒中的研究結果[25]相似。

醇類物質占刺梨酒總揮發性化合物含量的8%左右，多數醇類由酵母代謝氨基酸產生，香氣類型較為豐富，低濃度常具有清香、較高濃度易產生刺激性氣味。在MLF后的酒樣中檢測到26種醇類，總含量為1 409.50 μg/L，比對照增加218.30 μg/L，但總體占比降低0.29%。具有香料紫羅蘭氣味的紫蘇醇、正辛醇等僅在MLF后的酒樣中檢測到，而具有植物、青草氣味的反式-3-己烯-1-醇僅在對照酒樣中檢測到，但MLF的酒樣中也檢測到375.60 μg/L具有青草味的葉醇，具有玫瑰花香氣的苯乙醇由440.40 μg/L降至13.70 μg/L，說明MLF改變了刺梨酒中揮發性醇類物質的種類，但整體香氣類型變化不明顯，而總體高級醇占比下降對提高刺梨酒安全性有一定益處[26]。

刺梨酒中酸類物質含量經MLF后由1 040.40 μg/L增至2 490.60 μg/L，13種酸類化合物中十一烷酸、亞油酸、油酸和壬酸僅在MLF后的酒樣中檢測到，雖然這些高級飽和脂肪酸多數具有油脂、酸敗氣味，但因閾值較高，對刺梨酒影響有限。具有奶酪味的辛酸在MLF后由431.20 μg/L增加至1 658.60 μg/L，豐富了刺梨酒的奶酪氣息。

刺梨酒MLF后烷烴類化合物種類由13種減少到10種，但含量提高了171.70 μg/L，特別是具有花香、甜香的苯乙烯和4-甲氧基苯乙烯增加了198.70 μg/L；醛酮類和其他物質含量占揮發性成分的2%左右，刺梨酒MLF前后總含量變化不大，但具有清新植物氣味的庚醛在MLF后未檢測到，出現具有香料氣味的4-烯丙基苯甲醚、二氫沉香呋喃和2-甲氧基-5-丙-2-烯基苯酚。

2.2.2 MLF對OAV的影響 一般認為揮發性化合物含量大于其氣味閾值，即OAV≥1，化合物產生的香氣才可在氣味中獨立識別。由表2可知，MLF后刺梨酒的主要呈香物質(OAV≥1)共有13種，其中辛酸乙酯(OAV=928.18)是刺梨酒最主要的香氣物質，其他貢獻度大小依次為己酸乙酯(65.20)>乙酸異戊酯(34.48)>9-癸烯酸乙酯(23.25)>乙酸葉醇酯(13.68)>癸醛(7.88)>癸酸乙酯(4.50)>苯乙烯(2.41)>十一烷酸(2.35)>反式-肉桂酸乙酯(2.09)>乙酸苯乙酯(1.67)>癸酸甲酯(1.58)>4-辛酮(1.40)，其中具有青蘋果、黃瓜香氣的乙酸葉醇酯和奶酪香氣的十一烷酸僅在MLF后的酒樣中檢測到，具有植物、泥土氣味的庚醛(4.14)和反式-3-己烯-1-醇(2.28)則只在對照酒樣中檢測到，說明MLF提高了刺梨酒果香花香，特別是奶油乳酪香氣，同時減少了生青氣息，但依然保留了刺梨酒獨特的清新果味。對刺梨酒香氣具有重要修飾作用(0.1≤OAV<1.0)的物質檢測到10種，其中辛酸和葉醇僅在MLF的酒樣中檢測到，對刺梨酒香氣的影響與主要呈香物質基本一致。

2.3 MLF對刺梨酒感官評價的影響

采用QDA法對MLF前后的刺梨酒進行感官評定，結果見圖1。由圖1可知，刺梨酒MLF前后的共同主要味感描述為果香、花香、植物香、乳香、酸味、苦澀味。對照酒樣以果香、花香、植物香、酸味、苦澀味為主；MLF后的刺梨酒以果香、花香、乳香、酸味為主。相較于僅進行酒精發酵的刺梨酒，MLF后刺梨酒花香、植物香減弱、果香乳香增加、酸味減弱、苦澀味稍減弱，口感平衡度提升，風味輪廓發生變化，經過MLF的酒樣的整體評分高于對照組。

圖1 MLF對刺梨酒感官評定雷達圖Figure 1 Radar chart of sensory evaluation of Rosa roxburghii Tratt wine by malolactic fermentation

3 結論

研究采用離子色譜法測定出刺梨酒中有8種有機酸，蘋果酸—乳酸發酵使刺梨酒中蘋果酸含量顯著降低85.83%、乳酸含量顯著升高87.75%、乙酸含量增加0.11 g/L，對草酸、酒石酸、檸檬酸和琥珀酸含量無顯著影響；采用HS-SPME/GC-MS鑒定出蘋果酸—乳酸發酵后的刺梨酒中有114種、16 903.10 μg/L揮發性成分，其中酯類、醇類和酸類共占94.13%，為主要揮發性成分，蘋果酸—乳酸發酵后揮發性物質的種類和總含量均高于對照酒樣，僅在蘋果酸—乳酸發酵的酒樣中檢測到的成分主要有乙酸葉醇酯、DL-3-乙酰氧基丁酸乙酯、3-己烯酸乙酯、辛酸辛酯、肉桂酸異戊酯、乳酸異戊酯、紫蘇醇、正辛醇、十一烷酸、亞油酸、油酸、壬酸、4-烯丙基苯甲醚、二氫沉香呋喃等；經香氣活度值法分析辛酸乙酯是蘋果酸—乳酸發酵后刺梨酒的最主要呈香物質，乙酸葉醇酯和十一烷酸賦予刺梨酒奶油乳酪香氣；感官分析表明，蘋果酸—乳酸發酵增加了刺梨酒的果香和乳香，降低植物氣息、酸味和苦澀感。綜上所述，蘋果酸—乳酸發酵可通過降低刺梨酒蘋果酸含量、增加乳酸含量和具有果香、乳香氣味的揮發性物質含量和種類，改善刺梨酒風味、有效降低酸味、提高總體質量。關于刺梨酒蘋果酸—乳酸發酵的菌種選擇、接種方式、貯藏后的變化情況還需進一步研究。