羧甲基化南瓜多糖的制備及抗氧化、降血糖活性研究

李雪暉 羅心雨 王 瑩

(1. 南陽師范學院生命科學與農業工程學院，河南 南陽 473061；2. 廣東省生態環境技術研究所，廣東 廣州 510650)

南瓜(Cucurbita moschata duch)是葫蘆科南瓜屬草本植物的果實，在中國各地被廣泛種植，富含各種維生素、氨基酸、蛋白質、多糖等營養物質，是一種高營養、低脂的功能性食品，作為一種防治糖尿病的食品而備受關注[1-2]。南瓜多糖富含降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老等功能[3-4]的生物活性成分，作為自由基清除劑在預防氧化損傷方面起著重要作用，其降血糖活性在動物試驗和臨床試驗中得以證實[5]。

分子修飾是通過物理、化學及生物學等手段對化合物進行結構改造，以獲得眾多結構類型衍生物的方法。選用硫酸化、磷酸化、烷基化、羧甲基化等方式[6-7]對多糖分子結構進行適量修飾，能有效提高其生物學活性。通過向多糖的支鏈上導入羧甲基基團的羧甲基化修飾技術[8]在南瓜多糖修飾中使用較多，主要是由于其控制相對容易、生產成本低，且反應產物無毒性。多糖可捕捉過氧化鏈式反應中產生的活性氧，減少反應鏈的長度，阻斷或減緩反應的進行，起到清除自由基的作用，但對于羧甲基化南瓜多糖的抗氧化活性研究尚未見報道，且南瓜多糖的羧甲基化修飾結構與生物活性的關系也尚不明確。

文章擬以南瓜多糖為原材料，對其進行羧甲基化修飾，用紫外分光光度法對羧甲基化南瓜多糖取代度進行研究，并探討羧甲基化南瓜多糖對羥自由基、超氧陰離子自由基的清除作用以及α-葡萄糖苷酶抑制活性的抑制作用，期望通過羧甲基化的方式提高南瓜多糖的抗氧化活性和降血糖活性，為南瓜多糖的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟南瓜：市售；

一氯乙酸(MCA)、硫代巴比妥酸、鹽酸、濃硫酸、羥基乙酸(乙醇酸)、變色酸、維生素C、氫氧化鈉、鹽酸羥胺、無水乙醇、三氯化鐵、過氧化氫(30%)、葡萄糖、苯酚、木瓜蛋白酶等：國產分析純。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計：WFZ UV-2000型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9240A型，上海恒科學儀器有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HHS21-8型，上海博迅實業有限公司；

電子天平：JA2003型，上海市恒平科技科學儀器有限公司；

臺式離心機：DL-5A型，上海菲恰爾分析儀器有限公司；

高效液相色譜儀：G1362A型，美國安捷倫科技公司；

真空冷凍干燥機：FD-1D-50型，北京博醫康實驗儀器有限公司；

酶標儀：Multiskan MK3型，美國Thermo Fisher公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 南瓜多糖、羧甲基化南瓜多糖的制備

(1)南瓜粉：根據文獻[9]。

(2)南瓜多糖(PP)：根據文獻[10]。

(3)羧甲基化南瓜多糖(CM-PP)：稱取0.200 0 g PP，加入一定量的3.0 mol/L NaOH溶液，滴加一氯乙酸，一定溫度下反應一定時間，調節pH為7，過濾，透析，冷凍干燥得CM-PP。

1.3.2 PP含量和CM-PP取代度測定

(1)PP含量：采用苯酚—硫酸法[11-12]。

(2)CM-PP取代度：采用紫外分光光度法[13]。

1.3.3 單因素試驗

(1)一氯乙酸濃度：固定反應溫度70 ℃、反應時間3.0 h，考察一氯乙酸濃度(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mol/L)對羧甲基化多糖取代度的影響。

(2)反應溫度：固定反應時間3.0 h、一氯乙酸濃度1.5 mol/L，考察反應溫度(40，50，60，70，80 ℃)對羧甲基化多糖取代度的影響。

(3)反應時間：固定反應溫度70 ℃、一氯乙酸濃度1.5 mol/L，考察反應時間(2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h)對羧甲基化多糖取代度的影響。

1.3.4 響應面優化 在單因素試驗基礎上，以一氯乙酸濃度、反應溫度和反應時間為自變量，以羧甲基化多糖取代度為響應值，根據Box-Behnken試驗設計基本原理優化CM-PP制備工藝。

1.3.5 抗氧化活性試驗

(1)羥自由基清除率：分別取樣品溶液1 mL，依次加入1 mL FeSO4溶液(9 mmol/L)和水楊酸—乙醇溶液(9 mmol/L)，加入6 mL蒸餾水，搖勻。以等體積的蒸餾水代替樣品溶液作空白對照，以蒸餾水代替水楊酸為本底組。加入1 mL濃度為8.82 mmol/L 的H2O2溶液，37 ℃水浴1 h，測定510 nm處吸光度，按式(1)計算羥自由基清除率。

(1)

式中：

I——自由基清除率，%；

Ii——本底組吸光度；

Ij——樣品組吸光度；

I0——對照組吸光度。

(2)超氧陰離子自由基清除率：向試管中加入4.6 mL 濃度為50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)，25 ℃水浴20 min，分別加入1 mL樣品溶液，0.4 mL濃度為10 mmol/L 的鄰苯三酚溶液，搖勻，25 ℃水浴4 min，加入0.1 mL濃度為8 mol/L的HCl溶液終止反應，測定325 nm處吸光度，以蒸餾水取代樣品溶液為對照組，以蒸餾水取代鄰苯三酚溶液為本底組，并按式(1)計算超氧陰離子自由基清除率。

1.3.6 抑制α-葡萄糖苷酶活性試驗 根據文獻[14]略修改。向酶標板中加入80 μL磷酸緩沖液(pH 6.8)，加入16 μL樣液和α-葡萄糖苷酶溶液(0.2 U/mL)，37 ℃反應15 min；加入16 μL濃度為2.5 mmol/L的p-NPG溶液，37 ℃反應30 min；加入100 μL濃度為1.0 mol/L的Na2CO3溶液，用酶標儀測定λ=405 nm處吸光度，以阿卡波糖為陽性對照，按式(2)計算α-葡萄糖苷酶抑制率。

(2)

式中：

α——α-葡萄糖苷酶抑制率，%；

αi——本底組吸光度；

αj——樣品組吸光度；

α0——對照組吸光度。

1.4 數據處理

使用Origin 2019b軟件處理數據，并制圖；使用Design-Expert 8.06軟件構建響應面模型，并進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 CM-PP制備工藝優化

2.1.1 單因素試驗 由圖1(a)可知，隨著一氯乙酸濃度的升高，羧甲基化多糖取代度呈先上升后下降的趨勢。當一氯乙酸濃度為1.5 mol/L時，羧甲基化多糖取代度最大，可能是隨著一氯乙酸用量的增加，促使NaOH滲透到多糖分子中產生鈉鹽，增加了與一氯乙酸化學反應的機會，進而增加了羧甲基化多糖取代度；但一氯乙酸用量過多會加速一氯乙酸的水解，同時消耗部分NaOH，使反應過程體系pH值下降，從而不利于取代反應的進行，羧甲基化多糖取代度下降。因此，最佳一氯乙酸濃度為1.5 mol/L。

由圖1(b)可知，當反應溫度為40～70 ℃時，羧甲基化多糖取代度隨反應溫度的升高而增大，可能是溫度升高提高了化學反應試劑的活力，加快了羧甲基化反應；同時，升高溫度使原料迅速溶脹，顆粒中NaOH、一氯乙酸和分散劑的相互滲透能力增強，分子之間的有效接觸面積增多，因而取代度提高。當反應溫度>70 ℃時，羧甲基化取代度隨反應溫度的升高而減小，是因為溫度過高可能會破壞多糖的結構，從而引起焦糖化反應，同時副反應速率提高，會影響主反應速率，使一氯乙酸利用率降低；另外，由于環境溫度過高、分子運動加速導致分子結合力下降，使化學反應速率顯著下降，取代度降低。因此，最優反應溫度為70 ℃。

由圖1(c)可知，當反應時間為2.0～3.0 h時，羧甲基化多糖取代度與反應時間呈正相關關系，可能是反應活性中心隨反應時間的增加而增多，有利于多糖與一氯乙酸充分接觸，使得取代度逐漸增加。當反應時間為3.0 h時，取代度達到最高，當反應時間>3.0 h時，取代度與反應時間呈負相關關系，可能是反應過程中出現了副反應，從而使取代度降低。因此，最優的反應時間為3.0 h。

圖1 各因素對羧甲基化多糖取代度的影響Figure 1 Effects of various factors on the degree of substitution of carboxymethylated polysaccharide

2.1.2 羧甲基化南瓜多糖工藝優化 在單因素試驗基礎上，以一氯乙酸濃度、反應溫度和反應時間為試驗因素，以羧甲基化取代度為考察指標，并利用Design-Expert 8.06軟件構建三因素三水平響應面試驗。因素水平表見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 響應面試驗因素及水平設計Table 1 Response surface test factors and horizontal design

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 The Box-Behnken test scheme and results

運用Design-Expert 8.06軟件對試驗結果進行二次方程模型擬合，得二次回歸方程：

Y=1.18+0.17A+0.025B+0.037C+0.022AB-0.036AC+0.032BC-0.100A2-0.068B2-0.11C2。

(3)

由表3可知，模型F=21.32較高，顯著水平P=0.000 3 較低，因變量和全體不同自變量之間的線性函數關聯顯著。失擬項不顯著(P=0.100 3)，表明其他因素對取代度干擾較小，回歸模型與實際情況相符合。影響取代度大小的因素主次順序為一氯乙酸濃度>反應時間>反應溫度，但各因素之間的相互作用并不明顯(見圖2)。

圖2 各因素相互作用對羧甲基化取代度的影響Figure 2 Effect of interaction of various factors on degree of substitution of carboxymethylation

表3 響應值方差分析?Table 3 Analysis of variance of response value

最佳工藝條件為一氯乙酸濃度1.93 mol/L、反應溫度73.40 ℃、反應時間3.04 h，該條件下的CM-PP取代度理論值為1.254。

2.1.3 模型驗證 為了檢驗模型的穩定性和可行性，將最佳制備工藝條件修正為：一氯乙酸濃度1.9 mol/L、反應溫度73 ℃、反應時間3 h。該工藝條件下的羧甲基化多糖取代度為1.247(n=4)，與理論值非常相近，證明了響應面試驗法優化羧甲基化南瓜多糖制備工藝是合理可行的。

2.2 抗氧化活性

2.2.1 羥自由基清除能力 由表4可知，不同質量濃度下，PP、CM-PP樣品均存在不同的羥自由基清除率，具有明顯的羥自由基清除能力；且PP、CM-PP的羥自由基清除率隨質量濃度的提高呈劑量濃度依賴性關系[15]。從濃度角度考慮，維生素C、PP、CM-PP的IC50值分別為4.33×10-4，4.21×10-5，3.26×10-6mol/L，表明引入羧甲基基團能提高多糖對羥自由基的清除能力，且優于維生素C，可能與修飾后的多糖結構及羥基基團含量有關，與周際松等[16]的結果相似，可能是多糖鏈構象結構特征發生了改變，從而提高了羥自由基的清除能力。

2.2.2 超氧陰離子自由基清除能力 由表4可知，PP、CM-PP對超氧陰離子自由基的清除率與質量濃度有顯著的正相關關系[17-19]，與柳紅等[20]的研究結果一致。從濃度角度考慮，維生素C、PP、CM-PP的IC50值分別為5.14×10-4，1.54×10-5，3.06×10-6mol/L，說明CM-PP對超氧陰離子自由基的清除能力顯著提高，可能是在PP中引入了羧甲基基團，從而改變了多糖的生物學活性；并且其抗氧化活性高于維生素C。陳放[21]研究表明：苦瓜多糖經羧甲基化修飾后其清除作用增強，可能與多糖水溶性有一定的關系，其作用機制可能是抑制超氧自由基轉化為過氧化氫或羥自由基等活性氧。

表4 PP和CM-PP對自由基的清除率Table 4 Percentage scavenging of hydroxyl radical by PP and CM-PP (n=3)

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性

由圖3可知，PP、CM-PP對α-葡萄糖苷酶的抑制率與質量濃度呈正相關關系；但隨著質量濃度的增加，其抑制作用變化變小，表明南瓜多糖及羧甲基化南瓜多糖均有一定的抑制糖吸收的功能，降糖效果明顯略低于阿卡波糖，但與阿卡波糖呈大致平行的抑制曲線，這與趙駿等[22]的研究結果一致。牛慶川等[23]研究發現，羧甲基化紅棗多糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用明顯高于紅棗多糖，并闡明了降血糖相關的作用機理。同時，試驗發現南瓜多糖具有預防糖尿病、促進機體維持正常血糖的生理功能。因此，多糖可用于降血糖藥品、降血糖功能性藥品、天然保健食品等多種途徑[24]。查閱相關文獻[25]發現，南瓜多糖中引入了羧甲基基團，可能使其水溶性和電負性發生了改變或者增強，進而影響了抗氧化和降血糖等生物活性。

圖3 α-葡萄糖苷酶抑制率與多糖質量濃度的關系Figure 3 Relationship of α-glycosidase inhibitory activity and polysacchrides concentration

3 結論

通過響應面試驗法優化了羧甲基化南瓜多糖的制備工藝。結果表明，羧甲基化南瓜多糖的最佳制備工藝為：一氯乙酸濃度1.9 mol/L、反應溫度73 ℃、反應時間3 h，該條件下的羧甲基化南瓜多糖取代度為1.247，說明羧甲基化南瓜多糖的優化工藝是合理可行的。南瓜多糖和羧甲基化南瓜多糖均可以清除羥自由基和超氧陰離子自由基；與修飾前南瓜多糖相比，多糖的羧甲基化修飾也能提高其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，說明羧甲基化南瓜多糖具有較強的抗氧化活性和降血糖活性。后續可對羧甲基化南瓜多糖的降血糖作用機制進行分析。