膠紅酵母胞外多糖抗氧化活性及對藥物性肝損傷的護肝機制

李梅林 馬文錦 王 博 周彥兵 張永顯 于長青 彭 濤

(甘肅省輕工研究院有限責任公司，甘肅 蘭州 730000)

藥物性肝損傷(Drug-induced liver injury，DILI)是指在應用治療劑量的藥物時，由于藥物或其代謝產物引起的肝細胞毒性損傷，或肝臟對藥物及代謝產物的過敏反應所致的疾病[1]。DILI約占所有藥物不良反應的3.0%～9.0%，占肝炎患者的10%，隨著臨床藥物種類的不斷增加，DILI的發病率也隨之增多。DILI目前尚無特效療法，關鍵是早發現、早停藥，并特異性地給予保肝解毒藥物，其治療基本原則是停止用藥、查明原因、對癥支持治療[2]。因此，重視和加強DILI的發生與防治尤為重要。

膠紅酵母(R.mucilaginosa)是酵母種屬的一種，為單細胞真核生物[3-4]。課題組前期通過形態學、碳源/氮源同化試驗及18S rDNA生物學方法，鑒定菌株CM-1為膠紅酵母菌(R.mucilaginosa)。從R.mucilaginosaCM-1無機培養基中分離得到水溶性胞外多糖RmEPS，其產量為7.35 g/L，多糖RmEPS經纖維素交換柱、凝膠滲透等純化方法可得到單一組分多糖RmEPS-11。文章擬通過研究膠紅酵母胞外多糖對小鼠藥物引起肝損傷的保護作用，分析其潛在的分子機制，為膠紅酵母胞外多糖在功能性食品與藥品中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

昆明小鼠：體重16～24 g，雄性，動物許可證號SCXK(京)2016-0006，北京維通利華實驗動物技術有限公司；

膠紅酵母(RhodotorulamucilaginosaCM-1)菌株：陜西科技大學食品與生物工程學院微生物研究室；

抗壞血酸：分析純，河北鴻韜生物工程有限公司；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：分析純，北京百奧萊博科技有限公司；

2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：分析純，湖南韻邦生物醫藥有限公司；

偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)：分析純，上海基星生物科技有限公司；

異煙肼(INH)：生物試劑，西安利君制藥有限責任公司；

利福平(RIF)：生物試劑，鐘祥市耀威生物科技有限公司；

水飛薊素(Silymarin)：生物試劑，上海西寶生物科技股份有限公司；

超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒：上海朝瑞生物科技有限公司；

2,4-二硝基苯肼：分析純，成都聯禾化工醫藥有限責任公司。

1.1.2 儀器與設備

酶標分析儀：HBS-1096A型，南京德鐵實驗設備有限公司；

高速冷凍離心機：CT15RT型，上海天美生化儀器設備有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH-4型，金壇市宏華儀器廠；

實時熒光定量PCR儀：M381409型，北京中西遠大科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗氧化活性 根據課題組[5]前期研究測定DPPH自由基、ABTS自由基和氧自由基清除能力，以及還原力。

1.2.2 對異煙肼和利福平肝毒性的保護作用 將雌雄小鼠隨機分為4組，雌雄各半，每組8只。小鼠飼養1周后，采用相同給藥方式，每天給藥1次，持續給藥7 d，其他飼養條件正常，最后1 d給藥后，禁食禁水12 h后進行采樣處理。試驗組：① 空白對照組：注射0.9% NaCl溶液(20 mL/kg 的0.9% NaCl注射液)；② INH模型對照組：灌胃給藥INH(以0.74 mmol/kg按0.2 mL/10 g體重)；③ RmEPS-11模型處理組：在INH模型組基礎上，注射RmEPS-11溶液(按100 mg/kg進行肝保護)和300 mg/kg RIF；④ 水飛薊素組：100 mg/kg 水飛薊素和300 mg/kg RIF體重灌胃。

1.2.3 臟器指數測定及樣品處理

(1)血樣處理和臟器指數測定：根據文獻[6-9]并修改。每只小鼠稱重后，摘取眼球取血，將血樣保存用于后期生物理化指標測定，包括丙氨酸轉氨酶(ALT/GPT)、天冬氨酸轉氨酶(AST/GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、蛋白質總濃度(T-Protein)，丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)等。脫臼處死小鼠，剖腹取出肝和腎，觀察其顏色及大小變化程度，稱重。取肝臟右葉部分組織，一部分凍存用于測定生物指標，一部分樣品用錫箔紙包好放入無RNAase的EP管中，液氮速凍后轉入-80 ℃冰箱用于后期分子學試驗；另一部分用10%福爾馬林固定后，用于后續光鏡下檢驗其病理學變化。

(2)肝勻漿制備：將保存的部分肝臟用生理鹽水清洗，精確稱重，剪碎，與生理鹽水混勻制備肝勻漿組織[10]，離心，上清液于4 ℃保存。

(3)ALT/GPT的測定：按照試劑盒要求測定。

(4)AST/GOT的測定：按照試劑盒要求測定。

1.2.4 T-Protein測定 按照試劑盒要求測定。

1.2.5 SOD測定 按照試劑盒要求測定。

1.2.6 MDA測定 按照試劑盒要求測定。

1.2.7 GSH-PX測定 按照試劑盒要求測定。

1.2.8 病理學研究 經HE染色劑染色后[11]，光鏡下觀察肝組織的病理學變化。正常：肝組織結構相對正常，無變性等；1級：小葉結構正常，肝細胞略有脂肪變性，伴有輕度壞死；2級：變性程度加重，肝小葉可見明顯壞死；3級(+++)：肝小葉結構不清，可見明顯的大片狀壞死病灶。

1.2.9 相關基因CYP2E1及表達 采用熒光實時定量PCR對其相關基因CYP2E進行定量表達。以GAPDH為內參基因，將-80 ℃凍存的小鼠肝臟在mRNA轉錄水平上進行CYP2E1和CYP1A2的差異研究。

1.2.10 總RNA的提取純化 根據文獻[12-15]并修改。

(1)破碎勻漿：將樣品分別從-80 ℃冰箱中取出，加入液氮用研缽反復研磨成粉末狀，并于凍融前研碎，轉至加入RNAiso Plus的裂解液中，振蕩混勻。將勻漿液轉移至離心管中，室溫靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min。

(2)提取：將氯仿加至勻漿裂解液中，振蕩混勻，靜置。4 ℃、12 000 r/min離心5 min，吸取上清液，加入等體積異丙醇，混勻，靜置，4 ℃、12 000 r/min離心5 min。

(3)RNA沉淀的清洗和溶解：向沉淀中加入乙醇溶液，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，除去乙醇，添加一定量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80 ℃保存。

(4)熒光實時定量PCR：按照試劑盒說明加樣，在普通PCR的退火溫度附近選擇幾個溫度，用同一樣品，得到Ct值最小的為最佳溫度。

(5)統計學處理：采用SPSS 11.5統計軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 抗氧化活性分析

2.1.1 DPPH自由基清除能力 由圖1(a)可知，DPPH自由基清除活性隨樣品質量濃度的增加而增加。當樣品質量濃度為8 mg/mL時，RmEPS-11和維生素C的清除率分別為66.15%，97.62%。RmEPS-11的IC50值為2.96 mg/mL。綜上，RmEPS-11具有較高的DPPH自由基清除能力，提示RmEPS-11可以將電子或氫供給DPPH自由基。

2.1.2 ABTS自由基清除能力 由圖1(b)可知，RmEPS-11對ABTS自由基的清除能力隨樣品質量濃度的增加而增加。當樣品質量濃度為8 mg/mL時，RmEPS-11和維生素C的清除率分別為82.80%，99.57%，說明RmEPS-11表現出一定的ABTS自由基清除活性。

2.1.3 還原力 由圖1(c)可知，當樣品質量濃度為0～8 mg/mL 時，還原能力隨樣品濃度的增加而增大，當樣品質量濃度為8 mg/mL時，還原力高達0.753。

2.1.4 氧自由基清除能力(ORAC值) 經計算，RmEPS-11的ORAC值為(560.38±6.45)μmol TE/g。由圖1(d)可知，RmEPS-11具有強的氧自由基清除能力，主要因為多糖的氫原子貢獻給了環上的C—H鍵或醛糖、糖醛酸上的O—H和其他位點來清除自由基。

圖1 多糖RmEPS-11和抗壞血酸的抗氧化活性Figure 1 Free radical scavenging and reducing power activities of ascorbic acid and RmEPS-11

2.2 肝功能活性分析

由表1可知，通過異煙肼和利福平處理后AST和ALT含量顯著提高(P<0.01)，表明其增大了肝臟的氧化應激。與空白對照組相比，模型組AST和ALT含量顯著升高(P<0.01)。陽性對照組和RmEPS-11治療組與INH模型對照組相比，AST、ALT含量顯著降低(P<0.01)，因此AST、ALT可作為異煙肼和利福平肝毒性的評估指標。MDA、SOD和GSH含量也有類似變化。異煙肼和利福平處理后，試驗鼠體內MDA含量升高，SOD和GSH含量降低(P<0.01)，與空白對照組相比，表明脂質過氧化，導致異煙肼和利福平中毒。陽性對照組和RmEPS-11治療組與INH模型對照組相比，能降低MDA含量、調高SOD和GSH含量，最終接近模型組(P<0.01)，表明RmEPS-11在逆轉肝損傷過程中起到一定作用。

表1 通過RmEPS-11治療后血清中ALT、AST、SOD、MDA、GSH含量?Table 1 Effects of RmEPS-11 on serum ALT,AST levels and hepatic SOD activity,MDA and GSH content in rats

由圖2可知，對照組的小鼠肝臟病理切片顯示正常組織形態；用異煙肼和利福平處理的試驗鼠呈現肝硬化、經典的組織凝固性壞死、大量纖維化、單核細胞浸潤、出血、脂肪變性和再生結節的形成。RmEPS-11治療組和陽性對照組中未發現組織病理學變化。綜上，RmEPS-11能夠治療和改善異煙肼和利福平引起的肝損傷。

圖2 小鼠肝組織的病理切片Figure 2 Histological examination of liver tissue sections stained with HE(×400)

2.3 CYP2E1的表達

由圖3可知，CYP2E1在INH模型組中的表達量(1.90±0.42)與空白組(0.98±0.26)相比極顯著升高(P<0.01)，但SC陽性對照組(0.75±0.19)和RmEPS-11治療組(0.82±0.22)與INH模型組差異顯著(P<0.05)，CYP2E1表達量明顯降低。

異煙肼(INH)和利福平(RIF)是用于抗結核化療的一線藥物，具有潛在的肝毒性，可能導致藥物引起的肝損傷，如果這種肝毒性不能及早識別，后果是致命的，且引起肝毒性的發病機制是多方面的[16-17]。一些研究[18-20]表明，CYP2E1參與INH和RIF肝毒性的形成過程，可能是細胞內過多自由基或毒性代謝產物堆積，造成氧化應激引起肝毒性，而抗氧化劑可以保護細胞和組織免受各種疾病中活性氧和其他自由基的有害影響。

1.空白對照組 2.模型組 3.陽性對照組 4.RmEPS-11治療組圖3 CYP2E1 mRNA的表達Figure 3 The CYP2E1 mRNA expression in all groups

3 結論

在多糖抗氧化活性的基礎上評估了RmEPS-11對小鼠異煙肼和利福平引起的肝臟毒性的影響。結果顯示，與異煙肼和利福平處理的小鼠相比，RmEPS-11給藥后血清丙氨酸轉氨酶、天門冬氨酸氨基轉移酶水平和肝臟丙二醛含量顯著降低，肝臟超氧化酶活性和谷胱甘肽過氧化物酶含量顯著恢復。此外，肝臟的組織病理學損傷和凋亡肝細胞數量改善顯著。機制研究表明，保護作用主要是由于CYP2E1mRNA表達水平的調節，導致有害自由基和ROS的形成減少，同時抗氧化能力提高，多糖RmEPS-11通過抑制肝CYP2E1抑制脂質過氧化，增加自由基的清除。在此基礎上，后續應開展膠紅酵母胞外多糖的急毒研究，研究半數致死量或最大耐受量，為其后期的開發利用提供安全依據。