紅萍多糖結構特征、流變特性及抗氧化活性

姚月華 唐 寧 應熙銳 應朝陽 程永強

(1. 中國農業大學食品科學與營養工程學院植物源功能食品北京市重點實驗室，北京 100083；2. 福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；3. 福建省農業科學院農業生態研究所，福建 福州 350000)

紅萍，又名滿江紅(Azolla)，是一種與魚腥藻共生的水生蕨類植物，葉片細小，漂浮于水面[1]。其繁殖迅速，產量極高，廣泛分布在中國華南及西南地區的池塘、水田等地，作為一種傳統綠肥，被廣泛應用于畜禽養殖[2]、稻田增產[3]、生態保護[4]等領域。此外，紅萍中含有豐富的生物活性物質，如多糖、氨基酸、酚類、蒽酮類、微量元素等，其提取物具有抗氧化[5]、抑菌[6]、護肝[7]等功能。

多糖是由單糖通過糖苷鍵連接而成的生物活性大分子，由同一種單糖組成的為均一多糖，由兩個及以上單糖組成的為雜多糖[8]。Ramzani等[9]從小葉滿江紅中提取的陰離子多糖可以誘導巨噬細胞分泌促炎介質和細胞因子，發揮免疫調節作用。Zhao等[10]從鱗毛蕨中提取出一種水溶性多糖，該多糖能夠清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子。此外，蕨類植物來源的多糖還具有理想的流變特性，如黑樹蕨多糖提取物表現出剪切增稠及延伸黏度等特征，被應用于增稠劑、藥物載體等加工領域[11]。

目前，有關紅萍功能成分的研究主要集中在蛋白質、微量元素等方面，而有關紅萍多糖的研究尚未見報道。文章擬以墨西哥滿江紅為原料，通過熱水浸提，醇沉后得到紅萍多糖，對其結構特征、流變特性進行研究，同時探究其體外抗氧化活性，以期為紅萍多糖應用于功能性食品、生物醫學和制藥等行業提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紅萍：墨西哥滿江紅，福建省農業科學院農業生態研究所；

無水乙醇、丙酮、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、單糖標準品(葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖醛酸、核糖、阿拉伯糖、巖藻糖)：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

水溶性維生素E(Trolox)、3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(PMP)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、葡聚糖標準品、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：分析純，北京索萊寶生物技術有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

真空干燥箱：DZF6020A型，北京科偉永興儀器有限公司；

醫用離心機：TGL-185M型，長沙平凡儀器儀表有限公司；

高效液相色譜儀：1260 infinity型，德國Agilent Technologies公司；

凝膠滲透色譜儀：HLC 8420型，日本Hitachi公司；

紅外光譜儀：SPECTRUM 100型，美國PkinElmer公司；

紫外可見分光光度計：T6新世紀，北京普析通用儀器有限責任公司；

掃描電子顯微鏡：SU 8010型，日本 Hitachi 公司；

流變儀：SPECTRUM 100型，美國 PkinElmer 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅萍多糖的提取 參照江和棟等[12]的方法并修改：

紅萍干粉→粉碎過40目篩→無水乙醇85 ℃回流除雜→熱水浸提[料液比1∶30 (g/mL)，時間2.5 h，溫度92 ℃]→旋蒸濃縮→醇沉(4倍體積無水乙醇)→4 ℃冰箱靜置24 h→離心取沉淀→丙酮除雜→烘干→紅萍多糖

1.2.2 化學成分測定

(1)總糖含量：采用硫酸苯酚法[13]。

(2)蛋白質含量：采用考馬斯亮藍法[14]。

(3)糖醛酸含量：采用硫酸—咔唑法[15]。

(4)脂質含量：利用脂肪測定儀進行測定。

1.2.3 單糖組成 參照王麗波等[16]的方法并修改。稱量15 mg樣品，加入8 mL濃度為2 mol/L的三氟乙酸(TFA)，以氮氣封管，121 ℃水解 6 h。分別取單糖標準液和多糖水解液各100 μL，加入300 μL濃度為0.6 mol/L 的NaOH溶液，混勻，加入等體積 PMP-甲醇溶液，70 ℃水浴2 h。冷卻，加入 0.3 mol/L HCl調pH至6～7。經0.22 μm水系微孔膜過濾，進樣。色譜條件：色譜柱為 Agilent Hi-Plex 柱 (300 mm×7.7 mm，8 μm)，示差檢測器(IR)，流動相為超純水，流量0.6 mL/min，溫度70 ℃，進樣量25 μL。

1.2.4 分子量測定 參照郭南生等[17]的方法并略修改。配置3.0 mg/mL的樣品溶液，離心，過0.22 μm濾膜，進樣后記錄保留時間，根據標準曲線即可得到樣品的相對分子質量。

1.2.5 結構特征

(1)掃描電鏡(SEM)：取少量干燥后的紅萍多糖，真空鍍金，觀察樣品的表面形態。

(2)原子力顯微鏡(AFM)：配置0.1 μg/mL的紅萍多糖溶液，取少量滴在云母片上，晾干，觀察。

(3)傅里葉紅外光譜(FT-IR)：稱取2 mg紅萍多糖，與200 mg干燥的KBr混合研磨，掃描波長400～4 000 cm-1。

(4)剛果紅試驗：將1 mg/mL樣品溶液與等體積剛果紅溶液(100 μmol/L)混合，緩慢加入1 mol/L氫氧化鈉溶液。利用紫外全波長掃描儀對混合液的最大吸收波長進行測定。相同體積的蒸餾水作為空白對照。

1.2.6 流變特性測定 分別配置5，10，15，20，25，30 mg/mL 的紅萍多糖溶液進行靜態剪切測試。測定溫度25 ℃；模具為錐形板(直徑40 mm，間隙0.5 mm)。吸取1.0 mL多糖溶液，記錄1～100 s-1范圍內多糖溶液黏度隨剪切速率的變化數值。吸取20 mg/mL紅萍多糖溶液進行動態振蕩試驗。25 ℃下，記錄1～100 rad/s范圍內儲能模量(G′)和損耗模量(G″)的變化。

1.2.7 抗氧化活性測定

(1)DPPH自由基清除力：吸取2 mL不同質量濃度的多糖溶液于試管，加入2 mL濃度為2 mmol/L的DPPH甲醇溶液，混勻，避光反應30 min。測定517 nm處吸光度，同時測定DPPH甲醇溶液吸光度，利用Trolox作陽性對照。按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

R1——自由基清除率，%；

A0——空白組吸光度；

Ai——樣品反應液吸光度。

(2)ABTS自由基清除力：配置7 mmol/L ABTS原液，取5.0 mL與等體積2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，遮光保存12 h，得ABTS溶液。反應前去離子水稀釋，測定732 nm處吸光度值為0.70±0.02。向紅萍溶液中加入2.0 mL ABTS+工作液，渦旋混勻，避光反應30 min，測定732 nm處吸光度。以等體積去離子水作為空白對照，Trolox為陽性對照。按式(1)計算ABTS自由基清除率。

(3)羥自由基清除力：將1.0 mL磷酸緩沖溶液與0.2 mL 番紅(520 μg/mL)、1.0 mL乙二胺四乙酸鈉鐵(Ⅱ)溶液混合，加入1.0 mL紅萍多糖溶液，混勻，加入0.8 mL 過氧化氫(6%)溶液，37 ℃水浴30 min，測定515 nm 處吸光度，以等體積去離子水替代樣品為空白組，以等體積去離子水替代樣品和過氧化氫為對照組。按式(2)計算羥自由基清除率。

(2)

式中：

R2——羥自由基清除率，%；

A0——空白組吸光度；

Ai——樣品反應液吸光度；

A對照——對照組吸光度。

1.3 數據處理

每組試驗重復3次，采用Excel 2013軟件進行數據統計，SPSS 17.0軟件進行方差分析，結果以平均值±標準差表示，并采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 紅萍多糖化學組成

試驗表明，采用熱水浸提法所得紅萍多糖提取率為11.12%，高于大多數水生藻類多糖(1.5%～7.0%)[18]。由表1可知，紅萍粗多糖中總糖含量為67.80%，高于甘草粗多糖(37.10%)[19]，低于果實類粗多糖(88.20%)[20]，可能與植物葉子中含有較多的蛋白質、淀粉、木質素等雜質有關；糖醛酸含量為21.14%，表明樣品為酸性糖。此外，紅萍粗多糖中灰分含量為20.15%(K 10.40%,Ca 0.42%,Mg 0.46%)，蛋白質含量為5.65%，脂肪含量為0.82%。

表1 紅萍多糖的化學組成Table 1 Content of chemical components in polysaccharide from Azolla

2.2 單糖組成

由圖1可知，紅萍多糖為酸性雜多糖，由甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、巖藻糖、核糖、鼠李糖10種單糖組成，其相對摩爾質量占比分別為28.03%，24.30%，15.36%，13.65%，8.25%，3.16%，3.01%，1.51%，1.50%，1.24%。其中，甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖為紅萍多糖的主要單糖組成，與Ramzani等[9]的結論存在差異，說明樣品品種及種植地區可能會對紅萍多糖的理化組成產生影響。

圖1 紅萍多糖與標準樣品的高效液相色譜圖Figure 1 High performance liquid chromatography of Azolla polysaccharide and standard

2.3 分子量大小及分布

由圖2可知，紅萍多糖具有較寬的分子量，表明其分子量分布不均一，且以10.28，15.11 min出現的兩個峰為主，其峰面積占比分別為78.0%，19.3%，重均分子量(Mw)分別為2 338.00，1.60 kDa，數均分子量(Mn)分別為1 090.00，1.15 kDa，表明紅萍多糖分子量較大。

圖2 紅萍多糖分子量分布圖Figure 2 Molecular weight distribution curves of Azolla polysaccharide and standard

2.4 結構表征

圖3 紅萍多糖紅外光譜圖Figure 3 FT-IR spectra of Azolla polysaccharide

2.4.2 掃描電鏡 由圖4可知，紅萍多糖整體呈不規則的網狀結構，結構大小不一，不規則粘連，其表面質地均一且較為粗糙，表明多糖鏈連接較為緊密，可能是樣品分子量較大的原因之一。當提取方法不同時，多糖會呈不同的表面形貌，分別用熱水提取法和超聲提取法提取麥冬多糖，后者所得多糖的片狀更小，出現顆粒狀[24]。

2.4.3 原子力 由圖5可知，紅萍多糖分子主要以柔性鏈的形式存在，且鏈分布密度較大，表面存在較多的不規則顆粒，可能與樣品中存在一定的小分子礦物質有關。紅萍多糖表面為尖銳峰狀結構，分布較為緊密，其分子高度為2.1 nm左右，高于單個多糖鏈的平均高度(0.1～1.0 nm)[25]，表明紅萍多糖分子鏈中存在分支結構且互相交織。

2.4.4 三股螺旋結構 由圖6可知，當紅萍多糖存在時，隨著氫氧化鈉濃度的增加(0.00～0.15 mol/L)，剛果紅的最大吸收波長(Lmax)發生移動，當NaOH濃度超過1.5 mol/L 時，絡合物最大吸收波長急劇下降，直至平穩，表明紅萍多糖可能具有三股螺旋構象，且該構象被高濃度NaOH溶液破壞。三螺旋結構的多糖通常比單螺旋和無規卷曲的多糖具有更強的生物活性[26]。

圖6 紅萍多糖剛果紅反應變化曲線Figure 6 Congo red reaction curve of Azolla polysaccharide

2.5 流變學特性

由圖7可知，紅萍多糖的表觀黏度呈現出對樣品濃度和剪切速率的依賴性。表觀黏度隨樣品濃度的升高而增加，可能是因為高濃度下多糖鏈之間交聯區數量增加、多糖分子中羧基基團數量增加[27]，分子間作用力以及纏結率增大，增加了流體流動阻力，限制了聚合物鏈的運動和拉伸，從而使表觀黏度增大。此外，多糖溶液表觀黏度隨剪切速率的增加而降低，具有典型的剪切稀化行為，表明紅萍多糖溶液為非牛頓流體中的假塑性流體，這一現象可以歸因于剪切這一行為破壞了分子鏈的纏繞，減小了流動阻力[28]。

圖7 紅萍多糖的靜態剪切變化曲線Figure 7 Static shear curves of Azolla polysaccharide solution with different concentration

由圖8可知，當角頻率為0.01～100.00 rad/s 時，隨著頻率的增加，G′和G″均上升，對頻率有顯著依賴性。當角頻率較低時，G′G″，此時的樣品溶液主要表現為固體彈性性質。綜上，紅萍多糖存在一定的黏彈性，具有成為增稠劑和凝膠的潛在性質。

圖8 2%紅萍多糖溶液儲能模量與損耗模量變化曲線Figure 8 Storage (G′)and loss (G″)modulus of 2% Azolla polysaccharide solution

2.6 抗氧化活性

2.6.1 DPPH自由基清除力 由圖9(a)可知，當多糖質量濃度為0.1～1.0 mg/mL時，紅萍多糖對DPPH 自由基的清除能力與多糖質量濃度呈正相關，且清除率在1 mg/mL 時達80.15%。紅萍多糖、Trolox對DPPH自由基的半數抑制濃度(IC50值)分別為0.32，0.01 mg/mL。紅萍多糖的DPPH自由基清除能力顯著低于Trolox，但強于鱗毛蕨多糖(IC50值為2.04 mg/mL)[10]、蕨菜多糖(IC50值為0.82 mg/mL)[27]等蕨類多糖。

2.6.2 ABTS自由基清除力 由圖9(b)可知，當多糖質量濃度為0.2～2.0 mg/mL時，紅萍多糖對ABTS自由基的清除能力呈劑量依賴性提高，當樣品質量濃度為2.0 mg/mL 時，清除率達91.28%，接近0.1 mg/mL Trolox的清除率。紅萍多糖、Trolox對ABTS自由基半數抑制濃度(IC50值)分別為1.0，0.04 mg/mL，紅萍多糖對ABTS自由基的清除力低于Trolox，高于槐葉萍多糖(IC50值為3.25 mg/mL)[28]。

2.6.3 羥自由基清除率 由圖9(c)可知，當多糖質量濃度為0.2～2.0 mg/mL時，羥自由基清除率隨多糖質量濃度的增加而提升，但增長速率逐漸趨于平緩，且清除率在2.0 mg/mL時達最大值62.18%。與其他水生植物多糖相比，2.0 mg/mL的紅萍多糖對羥自由基的清除率低于同濃度下藍藻多糖(82.33%)[15]，但高于同濃度下裸藻多糖(50.14%)[29]。

圖9 紅萍多糖的抗氧化活性Figure 9 Antioxidant activity of Azolla polysaccharide

分子量、單糖組成、空間構象等因素均會影響多糖的抗氧化活性。王帥等[30]發現，多糖的抗氧化能力與其相對分子量呈正比，分子質量較大的多糖空間結構更復雜，易形成較多的分支和空腔，有助于自由基的去除。Yang等[31]研究表明，與中性糖相比，酸性多糖具有更強的氧化清除能力，且糖醛酸含量與抗氧化活性呈正相關。紅萍多糖為分子量較大的酸性雜多糖，空間結構較為復雜，可能是其具有良好抗氧化活性的重要原因。此外，葡萄糖醛酸作為良好的供氫體，對增強樣品的抗氧化能力具有關鍵作用。

3 結論

紅萍多糖是一種酸性雜多糖，主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖、葡萄糖組成。掃描電子顯微鏡下，紅萍多糖整體呈網狀結構，分子呈鏈狀分布且較為緊密。紅萍多糖存在糖類特征基團，具有吡喃環與三股螺旋結構。樣品溶液具有典型的剪切稀化行為，為非牛頓流體中的假塑性流體；且紅萍多糖溶液存在弱凝膠特征，后續可應用至食品添加劑方面。紅萍多糖對DPPH自由基、ABTS自由基和羥基自由基的半數抑制濃度(IC50值)分別為0.32，1.00，0.96 mg/mL，具有較好的抗氧化能力，可作為天然抗氧化劑。