結直腸癌組織中PLOD2、ZEB1表達變化及意義

張倩，段婷婷，任玉寶

1 山東國欣頤養集團萊蕪中心醫院消化科，濟南 271103；2 濟南市鋼城區人民醫院

結直腸癌（CRC）是臨床常見的消化系統惡性腫瘤，在男性和女性惡性腫瘤發病率中分別居于第五位和第三位，病死率均位列第三，其中我國的CRC發病率居于全球第一位［1-2］。新的診療手段的應用雖在一定程度上降低了病死率，但淋巴結轉移和遠處轉移的中晚期CRC 患者預后仍不理想［3］。賴氨酸羥化酶2（PLOD2）是一種存在于粗面內質網中的功能酶，可通過羥基化膠原蛋白中的賴氨酰殘基，進而促進細胞外膠原交聯的形成［4］。研究表明，PLOD2 可通過影響細胞外基質中膠原纖維變化促進腫瘤的侵襲與轉移［5］。近年研究發現，上皮間質轉化是結腸癌侵襲和轉移的重要分子機制，其中，轉錄因子E 盒結合鋅指蛋白1（ZEB1）在該過程中發揮重要調節作用［6］。ZEB1 是EMT 關鍵轉錄激活因子之一，與多種腫瘤細胞侵襲、轉移、耐藥性相關［7］。為此，我們探討了結直腸癌患者癌組織PLOD2、ZEB1表達及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取山東國欣頤養集團萊蕪中心醫院2013 年1 月—2016 年11 月手術切除的結直腸癌組織標本82例份及其對應的癌旁組織（距對應腫瘤邊緣≥3 cm 腸黏膜組織）。納入標準：患者均行結直腸根治手術及腸系膜淋巴結清掃術；術后病理均證實為結直腸腺癌；所有病例臨床資料完整；術前未進行放化療。排除標準：患有遺傳性結腸癌；合并其他惡性腫瘤；合并精神障礙性疾病或自身免疫系統疾病。患者男52 例、女30 例，年齡36～84（60.11 ±11.06）歲。組織分化程度參考2019 版WHO 病理分冊標準，高分化21 例，中分化48 例，低分化13 例。根據第8 版美國癌癥聯合委員會（AJCC）/國際抗癌聯盟（UICC）標準：浸潤深度T1+T2共47 例，T3+T4共35 例；淋巴結轉移23 例，不伴淋巴結轉移59 例；遠處轉移9 例；Ⅰ～Ⅱ期55 例，Ⅲ～Ⅳ期27 例。患者及其家屬均簽署知情同意書。本研究經我院倫理委員會批準。

1.2 結直腸癌組織及癌旁組織中PLOD2、ZEB1 表達檢測 所有標本均用10%甲醛緩沖液固定，石蠟包埋，切片（厚度4μm）。然后用二甲苯和分級乙醇對切片進行脫蠟和再水化。隨后，切片在磷酸鹽（PBS）緩沖鹽水（pH 7.2）中洗滌10 min。隨后室溫下于3%H2O2中封閉10 min，然后加熱至95 °C 30 min以回收抗原，并阻斷內源性過氧化物酶活性。在PBS 中洗滌3 次后，將切片在山羊血清中封閉，并與PLOD2、ZEB1 一級抗體在4°C 過夜。隨后，將載玻片與聚合物增強子（試劑A）、山羊抗鼠抗體（試劑B）一起孵育，并在新制備的3，3'-二氨基聯苯胺（DAB）底物中顯色4 min。最后，切片用蘇木精復染，脫水，風干，封片后鏡下觀察。所有染色結果由2 位高年資病理科醫師采用雙盲法獨立判斷。細胞染色強度評分：細胞無顯色為0 分，細胞淺黃色為1分，細胞呈棕黃色為2 分，細胞呈棕褐色為3分。細胞染色范圍評分：隨機選取10個200倍視野，每個視野計數約100個細胞，無染色為0分，＜25%為1分，≥25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，≥75%為4分。兩者相乘，＜3 分為陰性，≥3 為陽性。PLOD2 染色定于細胞膜或細胞質中，ZEB1染色主要定于為細胞核中。

1.3 預后隨訪 所有患者自確診起開始隨訪，隨訪時間為5 年，截止日期為2021 年1 月。隨訪方式為門診復查或者電話隨訪，隨訪終點為患者死亡或隨訪結束，期間排除因其他疾病或者意外死亡的病例。詳細記錄患者的生存情況，計算5 年總體生存率（OS）。

1.4 統計學方法 采用SPSS24.0 統計軟件。計數資料以［例（%）］表示，組間比較采用χ2檢驗（連續校正公式或Fisher 精確檢驗），相關性分析采用Spearman 分析。單因素分析應用Kaplan-Meier 和Log-Rank 檢測。應用Cox 回歸進行多因素生存分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC 癌及癌旁組織中PLOD2、ZEB1 陽性表達率比較 PLOD2 在癌旁組織中主要表達于腸黏膜隱窩內，陽性率15.85%（13/82），在CRC 組織中陽性率56.10%（46/82），兩者差異有統計學意義（P＜0.05）；ZEB1 在癌旁組織和CRC 組織中的陽性表達率分別為18.29%（15/82）、46.34%（38/82），兩者差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 CRC 組織中PLOD2 和ZEB1 表達與患者臨床病理參數的關系 CRC 組織中PLOD2 表達與組織分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM 分期均有關（P均＜0.05）；ZEB1 表達與浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期均有關（P均＜0.05）。見表1。

表1 PLOD2、ZEB1在CRC組織中表達與患者臨床病理參數間的關系（例）

2.3 CRC 組織中PLOD2 與ZEB1 的相關性 Spearman相關性分析結果顯示，PLOD2與ZEB1表達呈正相關（r=0.280，P=0.011）。

2.4 PLOD2 與ZEB1 表達與患者預后的單因素生存分析 隨訪時間6～60 個月，中位隨訪時間39.5個月，死亡25 例，總體5 年OS 69.5%（57/82）。PLOD2 陰性和陽性表達者5 年OS 分別為86.1%（31/36）、56.5%（26/46），差異有統計學意義（P＜0.05）；ZEB1 陰性和陽性表達者5 年OS 分別為84.1%（37/44）、52.6%（20/38），差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.5 影響CRC 患者預后多因素分析 多因素分析結果顯示，PLOD2表達、患者TNM分期是影響患者5年OS的獨立預后因子（P均＜0.05）。見表2。

表2 影響CRC患者預后的Cox多因素分析

3 討論

CRC 是常見的消化系統惡性腫瘤，近年來由于飲食習慣改變，膳食纖維攝入減少，發病率和病死率均呈上升趨勢，并且趨于年輕化。由于腫瘤早期癥狀不明顯，肛腸鏡篩查率低等原因，發現時往往已進展成中晚期。局部和遠處轉移是導致CRC 患者生存率降低的主要原因。研究表明，腫瘤細胞轉移，除了與自身黏附和侵襲能力相關，腫瘤微環境可能起重要作用［8］。細胞外基質（ECM）是腫瘤微環境的重要組成部分，而膠原蛋白是ECM 關鍵支架，被稱作是腫瘤細胞遷移和侵襲的“高速公路”［9］。

PLOD2 基因位于3q23-q24 染色體上，含有19個外顯子，亦稱LH2、TLH2或BRKS2，是一種同細胞膜結合的二聚體酶，主要通過對前膠原末端肽區中的賴氨酸殘基進行羥基化，使膠原纖維轉化為更高水平的羥賴氨酸醛衍生膠原交聯。研究表明，PLOD2 參與多種病理過程，包括系統性硬化、成骨不全和關節攣縮等［10］。在腫瘤ECM 中，未成熟的膠原蛋白被PLOD2 修飾后，發生沉積，增加了腫瘤細胞基質的硬度，使其不易被降解。因此，PLOD2 異常表達可引起ECM 重塑，從而導致TME 的改變，繼而參與腫瘤轉移［11］。NICASTRI 等［12］發現，PLOD2是CRC 組織中表達上調的糖蛋白。CHERIYAMUNDATH 等［13］發現，PLOD2 參與促進CRC 細胞浸潤。本實驗發現，PLOD2 在CRC 癌組織中表達增高，且與腫瘤細胞分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和TNM 分期相關。此外，本研究中Kaplan-Meier 單因素分析及Cox 模型多因素分析結果均顯示，PLOD2表達與CRC 總體生存期有關，高表達PLOD2者生存率降低，PLOD2 是CRC 患者預后獨立影響因素，與以往研究相符［4］。PLOD2調節CRC進展的機制尚不明確，最新研究發現，PLOD2 可能通過介導STAT3 信號通路，進而上調己糖激酶（HK2）表達促進CRC 的有氧糖酵解，進而調控CRC轉移［14］，同時PLOD2表達與腫瘤TNM分期呈正相關，與我們的研究結果一致。

EMT 在腫瘤惡性進展過程中，促進上皮細胞向間充質細胞轉化，從而增加腫瘤細胞侵襲和轉移的能力。研究表明，CRC 進展與EMT 密切相關［15］。EMT 關鍵轉錄因子ZEB1 可通過結合E-cadherin 啟動子上的保守E 盒序列，下調E-cadherin 表達，導致EMT 激活，誘導腫瘤細胞侵襲［16］。本研究結果顯示，CRC 組織中ZEB1 的陽性表達率高于癌旁組織，且與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和TNM 分期呈正相關。另外，本實驗Spearman 相關性分析發現，PLOD2 與ZEB1 表達呈相關，但具體機制尚不清楚。現有研究認為，PLOD2 通過參與腫瘤EMT 過程，影響腫瘤細胞遷移和侵襲能力［17］。因此，兩者可能在EMT 過程中存在某種關聯。研究發現，低氧環境可誘導PLOD2 表達，通過TGF-β/smad 信號通路和PI3K/AKT 信號通路，分別誘導宮頸癌和膠質瘤EMT 過程，促進腫瘤細胞侵襲和遷移［18-19］。而TGFβ/Smad 和PI3K/AKT 信號通路同樣可以激活ZEB1誘導腫瘤EMT 過程［20］，因此推測PLOD2 和ZEB1 可能在這兩個通路中存在某種聯系。

綜上所述，在CRC 組織中PLOD2、ZEB1 表達升高，二者表達與CRC 侵襲和轉移密切相關；檢測二者表達有助于病情判斷及患者預后評估。