非小細胞肺癌組織中miR-130a、GOLPH3表達變化及意義

宋金霞，秦虹，閻倩，蔡宏劍，杜以萍

青島市第八人民醫(yī)院腫瘤血液科，山東青島266000

摘要：目的 探討非小細胞肺癌（NSCLC）癌組織中微小RNA（miR）-130a、高爾基磷蛋白3（GOLPH3）表達及臨床意義。方法 選取87 例NSCLC 患者為研究對象，應(yīng)用 熒光定量PCR 檢測NSCLC 癌和癌旁組織中miR-130a、GOLPH3 mRNA 表達；采用免疫組化法檢測癌和癌旁組織中GOLPH3 蛋白表達。采用Pearson 線性相關(guān)分析miR-130a、GOLPH3 mRNA 表達的相關(guān)性，統(tǒng)計 分析miR-130a、GOLPH3 mRNA 表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。采用Kaplan-Meier 生存分析miR-130a、GOLPH3 表達對NSCLC 患者預(yù)后的影響，采用 Cox 回歸分析影響NSCLC 患者生存預(yù)后的危險因素。結(jié)果 與癌旁組織相比，NSCLC 癌組織中miR-130a 表達較低，而GOLPH3 mRNA 及蛋白表達較高（P 均＜0.05）。NSCLC 癌組織中miR-130a 表達與GOLPH3 mRNA 表達呈負相關(guān)（r=-0.457，P＜0.05）。miR-130a、GOLPH3 mRNA 表達與腫瘤TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05）。miR-130a低表達、GOLPH3高表達的NSCLC患者3年生存率低于miR-130a高表達、GOLPH3低表達患者（P均＜0.05）。TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-130a低表達及GOLPH3高表達是NSCLC 患者不良預(yù)后的獨立危險因素（P 均＜0.05）。結(jié)論 NSCLC 癌組織中miR-130a表達降低、GOLPH3表達升高，檢測 二者表達有助于NSCLC病情判斷及預(yù)后評估。

關(guān)鍵詞：非小細胞肺癌；微小RNA-130a；高爾基磷蛋白3；轉(zhuǎn)移；預(yù)后

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2022.10.004

中圖分類號：R734.2文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1002-266X（2022）10-0015-05

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，每年新發(fā)病患者數(shù)達180 萬，死亡患者數(shù)達159 萬［1］。非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見的類型，雖然近年來新的治療模式及治療藥物研究取得較大進展，NSCLC 患者的臨床預(yù)后有所改善，但患者5 年生存率僅20%［2］。深入研究NSCLC 疾病機制，對于改善患者臨床預(yù)后有重要意義。微小RNA（miR）是長度19～23 個核苷酸的分子，能轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達，在細胞分化、增殖等過程中發(fā)揮重要作用［3］。miR-130a基因位于15號染色體。研究報道，miR-130a在宮頸癌、肝癌等惡性腫瘤中異常表達下調(diào)，通過調(diào)控磷脂酰肌醇三激酶/AKT 通路，促進腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移等［4-5］。高爾基磷蛋白3（GOLPH3）基因位于5p13.3，編碼蛋白質(zhì)高爾基體的外周膜蛋白，能維持高爾基體帶狀結(jié)構(gòu)、囊泡運輸和高爾基體糖基化。研究表明，GOLPH3在包括黑色素瘤、肺癌等多種實體瘤類型中表達升高，促進癌癥相關(guān)糖蛋白的糖基化，與多種腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)［6-7］。2017 年1月—2018 年9 月，我們檢測了NSCLC 癌組織中miR-130a與GOLPH3表達，并分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017 年1 月—2018 年9 月于青島市第八人民醫(yī)院診治的87 例NSCLC 患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理組織檢查結(jié)果明確為NSCLC，有兩位病理科醫(yī)師共同診斷；②既往無放化療等治療病史；③資料完整，患者及家屬能夠配合本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴肺炎、肺膿腫等感染性疾病；②合并其他惡性腫瘤或腫瘤治療史；③一般狀況較差，伴嚴重臟器功能衰竭。NSCLC 患者男52 例、女35 例，年齡33～78（61.5±6.9）歲；病理類型：腺癌57 例，鱗癌30 例；腫瘤直徑：≤5 cm 者53例，＞5 cm 者34 例；腫瘤TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期62 例，Ⅲ期25 例。組織分化程度：高中分化42 例，低分化45 例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63 例。采用門診定期檢查或電話隨訪的形式追蹤患者預(yù)后情況，截止隨訪時間為2021 年9 月。患者均知情并簽署同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理201912014）。

1.2 NSCLC 組織中miR-130a、GOLPH3 mRNA 表達檢測 采用RT-qPCR 實驗。收集癌和癌旁組織（距癌組織邊緣2 cm以上），-80 ℃保存。實驗時取30 mg組織標(biāo)本，液氮中研磨后，TRIzol 法提取組織RNA，Nrodrop1000（美國，賽默飛）鑒定總RNA的濃度及純度，OD260/OD280為1.8～2.1。以RNA 為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，進行qPCR 反應(yīng)。miR-130a 正向引物：5'-GCCTCCAGAAACGGTCCAG-3'，反向引物：5'-GTCAATACACCCTTTTCCACCA-3'；以U6 為內(nèi)參基因，正向引物：5'-AGGAAGCCGTTCTTGACAAATG-3'，反向引物：5'-GGCATGAGCCAGGTAAATGAG-3'。 GOLPH3 正 向 引 物 ：5'-CAAGGACCGCGAGGGTTAC-3'，反向引物：5'-TTACGTCTCATTCCACAAGCC-3'；內(nèi)參基因GAPDH正向引物：5'-CTCACCGGATGCACCAATGTT-3'，反向引物：5'-CGCGTTGCTCACAATGTTCAT-3'。總反應(yīng)體系20 μL，cDNA 1 μL，正反向引物各1 μL、SYBR Green 10 μL，雙蒸水7 μL。反應(yīng)程序：95 ℃5 min，95 ℃30 s、60 ℃60 s、70 ℃延伸12 s 共40 個循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCt法計算。

1.3 組織中GOLPH3 蛋白表達檢測 采用免疫組化法。石蠟包埋組織后切片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟兩遍，各10 min；梯度乙醇水化，各5 min；抗原熱修復(fù)：檸檬酸緩沖液中微波爐加熱至煮沸10 min；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷：避光室溫滴加3%雙氧水；3%羊血清封閉2 h；一抗4 ℃避光過夜（GOLPH3稀釋比1∶400，購自Abcam 公司，貨號ab236296）；二抗室溫孵育30 min；DAB 顯色液顯色30 s；蘇木素染核5 min；鹽酸乙醇分化10 s；梯度乙醇脫水，各5 min，中性樹脂封片。鏡下（×200）觀察陽性染色強度和范圍，然后進行染色評分，染色評分=染色強度（0 為無染色，1為染色淺，2為染色深）與染色面積（0為≤25%，1為25%～50%，2為≥50%）的乘積評估。評分＜2分為陰性表達，≥2分為陽性表達［8］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以±s 表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。miR-130a與GOLPH3表達的相關(guān)性采用Pearson 線性相關(guān)分析。Kaplan-Meier 生存分析miR-130a、GOLPH3 表達與患者生存預(yù)后的關(guān)系。單因素及多因素Cox回歸分析影響NSCLC患者預(yù)后的危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌與癌旁組織中miR-130a、GOLPH3 mRNA 表達比較 與癌旁組織相比，NSCLC 癌組織中miR-130a 表達較低（t=29.602，P＜0.05），GOLPH3 mRNA表達較高（t=25.032，P＜0.05）。見表1。

表1 癌與癌旁組織中miR-130a、GOLPH3 mRNA表達比較（±s）

表1 癌與癌旁組織中miR-130a、GOLPH3 mRNA表達比較（±s）

組織癌組織癌旁組織n 87 87 tP GOLPH3 mRNA 1.665±0.302 0.744±0.163 25.032＜0.05 miR-130a 0.631±0.125 1.745±0.328 29.602＜0.05

2.2 癌與癌旁組織中GOLPH3 蛋白表達 NSCLC癌與癌旁組織中GOLPH3 蛋白表達陽性率分別為75.86%（66/87）、17.24%（15/87），癌組織中GOLPH3 蛋白表達陽性率高于癌旁組織中（χ2=60.079，P＜0.05）。

2.3 癌組織中miR-130a 與GOLPH3 mRNA 表達的相關(guān)性 NSCLC 癌組織中miR-130a 與GOLPH3 mRNA表達呈負相關(guān)（r=-0.457，P＜0.05）。

2.4 miR-130a、GOLPH3 mRNA 表達與NSCLC 患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 NSCLC 癌組織中miR-130a、GOLPH3 mRNA 表達與腫瘤TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05），與性別、年齡、病理類型、腫瘤直徑及組織分化程度無關(guān)（P均＞0.05）。見表2。

表2 miR-130a、GOLPH3 mRNA表達與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.5 miR-130a、GOLPH3表達對NSCLC患者生存預(yù)后影響 87 例NSCLC 患者隨訪過程中死亡31 例，3年總體生存率64.4%（56/87）。以癌組織中miR-130a、GOLPH3 mRNA表達的平均數(shù)0.631、1.665為界，分別分為高、低表達兩組。miR-130a 低表達組的3 年總體生存率為48.8%（21/43），高表達組為79.5%（35/44），miR-130a 低表達組3 年總體生存率低于高表達組（χ2=5.194，P＜0.05）。GOLPH3 高表達組、低表達組3 年總體生存率分別為43.5%（20/46）、87.8%（36/41），GOLPH3 高表達組3 年總體生存率低于低表達組（χ2=6.034，P＜0.05）。

2.6 影響NSCLC 患者預(yù)后的危險因素 以生存狀態(tài)為因變量（1=死亡，0=存活，t=生存時間），以年齡、性別、腫瘤直徑、病理類型、組織分化程度、腫瘤TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-130a、GOLPH3 為自變量。Cox 回歸分析結(jié)果顯示，TNM 分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-130a 低表達、GOLPH3 高表達是影響NSCLC患者不良預(yù)后的獨立危險因素，見表3。

表3 多因素Cox分析影響NSCLC患者預(yù)后的危險因素

3 討論

我國肺癌疾病負擔(dān)重，患病率57.26/10 萬，致死率45.87/10 萬，嚴重威脅我國人民健康［9］。NSCLC 占肺癌所有類型的80%。目前臨床上NSCLC 的治療方法主要包括手術(shù)、放化療及免疫治療等。但目前免疫檢查點治療的有效率僅20%［10］。深入研究NSCLC 的疾病機制，尋找能夠有效預(yù)測患者臨床預(yù)后的分子標(biāo)志物，對于臨床治療方案的選擇有重要意義。目前評估NSCLC 患者預(yù)后的因素包括腫瘤TNM 分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素和腫瘤突變負荷、表皮生長因子受體等癌基因的突變狀態(tài)等，在評估NSCLC 患者預(yù)后、治療方案選擇等方面具有重要的臨床價值［11］。

非編碼RNA 是蛋白表達功能的一類RNA 分子，根據(jù)長度可分為長鏈非編碼RNA 和miRNA［12］。miRNA 廣泛參與調(diào)控下游靶基因的表達，影響細胞分化發(fā)育及衰老等過程，與心血管疾病、自身免疫疾病及腫瘤等關(guān)系密切［13］。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中miR-130a 作為一種抑癌基因，發(fā)揮抑制腫瘤惡性進展的作用［14］。POODINEH 等［15］報道，miR-130a 能通過阻斷Wnt 信號通路的信號傳導(dǎo)，進而抑制腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移，其低表達與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，NSCLC 癌組織中miR-130a 表達下調(diào)，其機制尚不清楚，可能與腫瘤發(fā)生時的表觀遺傳學(xué)修飾有關(guān)。RAMALHO 等［14］研究報道，腫瘤發(fā)生時miR-130a 啟動子區(qū)域甲基化程度增加，導(dǎo)致miR-130a 表達沉默，進而促進腫瘤細胞的惡性進展。此外，miR-130a 表達與NSCLC 患者腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-130a 低表達促進NSCLC的腫瘤進展。DING等［16］研究發(fā)現(xiàn)，miR-130a能夠抑制腫瘤細胞腫瘤壞死因子α 的表達，而腫瘤壞死因子α能抑制腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的腫瘤殺傷功能。此外，體外細胞實驗表明，miR-130a 表達下調(diào)導(dǎo)致Kruppel 樣因子3 表達異常升高，而Kruppel 樣因子3 促進肺腫瘤細胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移等行為［17］。本研究結(jié)果顯示，miR-130a 低表達是患者不良預(yù)后的獨立危險因素，提示檢測NSCLC 癌組織中miR-130a 表達有助于判斷患者的臨床預(yù)后，進而指導(dǎo)臨床決策。

GOLPH3 是一種高度保守的蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量為34 kD，GOLPH3在反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)和內(nèi)體結(jié)構(gòu)之間移動，參與諸多重要細胞過程，如運輸、受體再循環(huán)和蛋白質(zhì)糖基化等［18］。近年來，GOLPH3已被證明與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。GOLPH3過表達可通過增強mTOR 信號通路的活性來促進細胞轉(zhuǎn)化，與多種實體瘤（如膠質(zhì)瘤和肝細胞肝癌）的不良預(yù)后相關(guān)［19-20］。然而，GOLPH3 在NSCLC 中的發(fā)病機制尚不清楚。本研究中，NSCLC 癌組織中GOLPH3 mRNA 及蛋白表達均明顯升高，表明NSCLC 癌組織中GOLPH3 表達升高。GOLPH3 表達受到上游轉(zhuǎn)錄因子E2F 的表達調(diào)控，NSCLC 發(fā)生時，E2F 表達顯著上調(diào)，其通過結(jié)合GOLPH3 啟動子區(qū)域，促進GOLPH3 的表達［21］。此外，腫瘤中GOLPH3 表達亦受到上游miR-134 的表達調(diào)控。研究報道，腫瘤中miR-134 表達下調(diào)，致使miR-134 無法結(jié)合并抑制GOLPH3 mRNA 表達，導(dǎo)致腫瘤GOLPH3 蛋白表達上調(diào)［21］。本研究中，NSCLC 癌組織中GOLPH3 表達與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，高分期及伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中GOLPH3 表達較高，提示GOLPH3表達促進NSCLC 腫瘤進展。研究報道，GOLPH3 能通過穩(wěn)定纖溶酶原激活物抑制因子1 表達，促進腫瘤細胞的糖代謝，進而促進腫瘤細胞的增殖［20］。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，GOLPH3能促進腫瘤細胞中Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的激活，促進下游血管內(nèi)皮生長因子表達，導(dǎo)致腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強及腫瘤血管新生［22］。本研究中，GOLPH3 高表達與患者不良預(yù)后有關(guān)，并且是NSCLC 患者不良預(yù)后的獨立危險因素。因此，檢測癌組織中GOLPH3 表達有助于評估NSCLC 患者的臨床預(yù)后。本研究進一步分析NSCLC 癌組織中miR-130a 與GOLPH3 表達的相關(guān)性，結(jié)果兩者呈負相關(guān)。目前兩者間的作用關(guān)系尚不清楚，推測其機制可能是miR-130a 負性調(diào)控GOLPH3表達。國內(nèi)有學(xué)者在肺癌細胞系中應(yīng)用雙熒光素酶報告實驗證實，miR-130a 能靶向結(jié)合GOLPH3，并抑制GOLPH3 表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖及遷移［23］。因此，miR-130a 與GOLPH3 有望成為NSCLC 中新的分子標(biāo)志物。本研究尚存在以下不足，一方面，本研究樣本例數(shù)有限，需今后擴大樣本量深入研究；另一方面，本研究是回顧性研究，可能存在一定偏倚，有待設(shè)計前瞻性研究進一步驗證。

綜上所述，NSCLC 患者癌組織中miR-130a 表達下調(diào)，而GOLPH3表達上調(diào)，兩者在癌組織中的表達與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，共同促進NSCLC 腫瘤的發(fā)生發(fā)展。