基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究大黃牡丹湯治療闌尾炎的作用機制及分子基礎(chǔ)

朱遠貴 朱志成 馮波 夏雨

（江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院普外一科 南昌 330003）

闌尾是盲腸的一部分，它的根部連接于盲腸的后內(nèi)側(cè)壁，闌尾炎會表現(xiàn)為右下腹疼痛及壓痛。急性腹痛最常見的病因就是急性闌尾炎，急性闌尾炎需手術(shù)治療[1]。闌尾炎終生患病風(fēng)險為6%～7%。闌尾炎好發(fā)于青少年人群，發(fā)病率在20～30 歲達到高峰[2]。闌尾炎常用治療方式雖然為手術(shù)治療，但是中藥復(fù)方輔助治療仍舊起到了不可忽略的作用[3]。大黃牡丹湯為瀉下復(fù)方，具有瀉熱破瘀、散結(jié)消腫之功效，主治腸癰初起，濕熱瘀滯證[4]，臨床常用于治療急性單純性闌尾炎、急性膽道感染等濕熱瘀結(jié)證[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法為現(xiàn)代研究的先進成果，它不僅符合中藥復(fù)方整體、系統(tǒng)之理念，且深入于微觀分子層面，可從現(xiàn)代化角度解釋中藥復(fù)方作用機制，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展做出了不可忽略的貢獻[6]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討大黃牡丹湯治療闌尾炎的分子機制，以期為中藥復(fù)方治療闌尾炎研究提供有效參考。現(xiàn)報道如下：

1 工具與方法

1.1 大黃牡丹湯化學(xué)成分篩選及活性靶點構(gòu)建在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中，檢索大黃牡丹湯中“大黃、牡丹皮、桃仁、冬瓜子、芒硝”每味中藥化學(xué)成分，設(shè)置口服利用度（Oral Availability， OB）≥30%，類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18 作為篩選條件[7]。

1.2 大黃牡丹湯作用靶點、 闌尾炎疾病靶點Venn分析及中藥活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫搜索大黃牡丹湯活性成分對應(yīng)的作用靶點，并校正相應(yīng)靶點，以關(guān)鍵詞“appendicitis”檢索Genecards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/），搜集闌尾炎相關(guān)疾病靶點，采用Excel 2019 分析并繪制Venn 圖，運用Cytoscape 3.6.0 構(gòu)建大黃牡丹湯活性成分-潛在靶點-闌尾炎疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡(luò)拓撲分析、核心靶點的篩選、 富集分析 運用String 平臺對交集靶點進行分析，限定種屬為“Home sapiens”人源，分析模式選擇“Multiple proteins”，置信度設(shè)置為0.4，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。將網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 運用CytoNCA 插件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析[8]。將核心靶點導(dǎo)入David 平臺，對大黃牡丹湯治療闌尾炎的核心靶點進行基因本體（GO）分子功能和基因組百科全書（KEGG） 信號通路富集分析，物種選為“Home sapiens”，以錯誤發(fā)現(xiàn)率（False Discovery Rate，F(xiàn)DR）＜0.05 作為顯著功能和通路的臨界值，獲取相應(yīng)的數(shù)據(jù)，繪制相應(yīng)圖形[9]。

2 結(jié)果

2.1 大黃牡丹湯有效成分 最終獲得大黃牡丹湯有效活性成分11 種，其中大黃6 種、牡丹皮2 種、桃仁2 種、冬瓜子1 種。有效化合物信息見表1。

表1 大黃牡丹湯活性化合物成分信息

2.2 大黃牡丹湯作用靶點、 闌尾炎疾病靶點Venn分析及中藥活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò) 通過TCMSP 檢索化合物對應(yīng)靶點得化合物靶點526 個，經(jīng)過刪除重復(fù)值、Uniprot 數(shù)據(jù)庫校正后得到166 個有效靶點；搜索Genecards 數(shù)據(jù)庫獲得闌尾炎疾病靶點709 個。對兩者靶點進行Venn 分析得交集靶點62 個。見圖1。將62 個核心靶點對應(yīng)的活性化合物及闌尾炎疾病靶點通過Cytoscape 構(gòu)建大黃牡丹湯活性成分-潛在靶點-闌尾炎疾病網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。

圖1 大黃牡丹湯與闌尾炎交集靶點Venn 圖

圖2 大黃牡丹湯活性成分- 潛在靶點- 闌尾炎疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)拓撲分析、 核心靶點篩選、富集分析 將62 個潛在靶點導(dǎo)入String平臺進行PPI 網(wǎng)絡(luò)拓撲分析。見圖3。再將String 平臺生成的tsv 格式文件導(dǎo)入Cytoscape 使用CytoNCA 插件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，計算各個網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的DC、BC、CC，取DC、BC、CC 值前6 位節(jié)點進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，最終得到白細胞介素-6（Interleukin6，IL-6）、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor， TNF）、蛋白激酶B1（AKT1）、腫瘤蛋白P53（TP53）、VEGFA、JUN 6 個核心靶點。見圖4。其靶點拓撲分析信息見表2。將6 個核心靶點導(dǎo)入David平臺進行GO、KEGG 富集分析，設(shè)置閾值為：生物過程（Biological Processes， BP）、細胞組分（Cellular Component， CC）、分子功能（Molecular Function，MF）count≥5，ease≥0.1，按照P值升序取排列前10條GO 富集信息[10]。見圖5。KEGG 富集分析設(shè)置閾count≥5，ease≥0.1，按照P值升序取排列前20 條KEGG 富集信息。見圖6。GO 富集分析顯示靶點基因主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、平滑肌細胞增殖正調(diào)控、蛋白磷酸化正調(diào)控等；KEGG 富集結(jié)果顯示大黃牡丹湯可能具有調(diào)控FoxO 信號通路、鞘脂類信號通路、Toll 樣受體信號通路等功效。

表2 靶點及分子拓撲信息

圖3 大黃牡丹湯潛在靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 大黃牡丹湯核心靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

圖5 大黃牡丹湯核心靶點的GO 富集分析

圖6 大黃牡丹湯核心靶點的KEGG 富集分析

3 討論

大黃牡丹湯的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究顯示，大黃牡丹湯主要作用于AKT1，蛋白激酶AKT1 是細胞內(nèi)生長因子信號傳導(dǎo)的主要效應(yīng)因子之一，引發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵基因[11]。大黃牡丹湯可能通過調(diào)控AKT1基因表達抑制炎癥反應(yīng)從而達到治療闌尾炎的療效。臨床研究顯示，闌尾炎患者IL-6、TNF、TP53 基因表達均高于正常組，這表明IL-6、TNF、TP53 基因的異常表達為引發(fā)闌尾炎的關(guān)鍵基因，調(diào)控這些基因的表達可能會對闌尾炎達到治療作用[12]。富集分析結(jié)果表明，大黃牡丹湯主要參與FoxO 信號通路、鞘脂類信號通路、癌癥通路、腫瘤壞死因子信號通路、Toll 樣受體信號通路。此外，核心靶點相關(guān)疾病包含恰加斯病（美洲錐蟲病）、前列腺癌、黑素瘤、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、癌癥的中樞碳代謝、非小細胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌。這表明大黃牡丹湯可能有這些疾病的治療優(yōu)勢。

大黃牡丹湯重要活性化合物為大黃酸、蘆薈大黃素、山柰酚、槲皮素、谷甾醇、豆甾醇等。其中大黃酸、蘆薈大黃素為中藥大黃中可提取的蒽醌類化合物，藥理活性多樣，包括具有保護心血管、抗腫瘤、抗炎、抗癌、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理活性[13]。槲皮素是一種天然的生物活性類黃酮，存在于多種蔬菜和水果中，在多種人類癌細胞中顯示出良好的抗轉(zhuǎn)移特性，經(jīng)槲皮素作為對照條件下的細胞傷口愈合時間延遲，這表明經(jīng)槲皮素處理的細胞中AKT1 基因表達明顯下調(diào)[14]。研究發(fā)現(xiàn)山柰酚能顯著抑制MAPK 通路的表達，干擾素誘導(dǎo)的IL-6 炎癥因子的產(chǎn)生，從而有效抑制炎癥的發(fā)生[15]。

大黃牡丹湯有效成分多樣，作用網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，本研究選取的核心有效成分為直接作用于闌尾炎癥狀治療的成分，并未系統(tǒng)體現(xiàn)該復(fù)方瀉熱破結(jié)、散結(jié)消腫之中醫(yī)理論，其他成分也可能通過間接作用發(fā)揮治療闌尾炎效果，這有待后續(xù)研究進一步考證。