類孟買血型FUT1、FUT2基因突變及家系遺傳分析

劉秋菊，蔣賢國

蒼南縣人民醫院 輸血科，浙江 溫州 325800

目前國際輸血協會（International Society of Blood Transfusion, ISBT）命名發布紅細胞血型系統已有43個，除ABO、Rh血型系統外還有一個重要血型系統-H血型系統，該H抗原受控于α-1，2-巖藻糖基轉移酶基因（α-1，2-fucosyltransferase,FUT1）（H）編碼的α-1，2-巖藻糖轉移酶的作用，另一種水溶性H抗原受控于FUT2基因（或Se）編碼的α-1，2-巖藻糖轉移酶的作用，當FUT1和或FUT2基因突變時，導致H抗原的全部或部分缺失，產生孟買型、類孟買型等稀有血型[1-2]。近期我們在臨床上發現了1例類孟買血型，對其進行FUT1、FUT2基因測序及家系遺傳分析，現將結果報告如下。

1 對象和方法

1.1 對象 先證者，男，65歲，漢族，2019年12月12日因“泡沫尿多年、血肌酐升高”就診于蒼南縣人民醫院，12月22日檢測血型時發現血型結果凝集減弱，經先證者及家人簽署知情同意書后，抽取其妻子、女兒靜脈血液進行血型血清學鑒定及基因檢測。本研究獲蒼南縣人民醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑儀器 單克隆抗-A、抗-B血型定型試劑（批號20190713）、抗-A1凝集素試劑（批號20190607）、單克隆抗-H血型定型試劑（批號20190926）均由上海血液生物醫藥有限責任公司提供；反定型人A、B、O型紅細胞留取3人份同型供血者血液由本科室制備，當天使用；DNA提取液由北京天根生化科技有限公司提供，人類ABO血型基因分型檢測試劑盒、人類H血型系統基因分型檢測試劑盒（PCR-SBT法）由江蘇偉禾生物科技有限公司提供，嚴格按試劑的說明書進行操作；電泳儀（EPS300，上海天能科技有限公司）、高速臺式離心機（MICRO17，美國Thermo公司）、凝膠成像系統（Tanon-2500，上海天能科技有限公司）、PCR儀（ABI 9700，美國ABI公司）、DNA測序儀（ABI 3130，美國ABI公司），嚴格按照儀器說明書進行操作。

1.3 方法

1.3.1 血型血清學試驗：ABO正反定型、H抗原采用試管凝集法，嚴格根據試劑說明書操作；吸收放散試驗、ABH血型物質檢測按照《全國臨床檢驗操作規程》。判斷標準：紅細胞與抗-H血清不凝集者為類孟買型，否則為非類孟買型。

1.3.2 DNA提取：采用DNA提取液對其進行DNA結合和純化，核酸樣本ODA260/A280：1.6～2.0，采用磁珠法。

1.3.3 ABO基因測序：嚴格按人類ABO血型基因分型檢測試劑盒說明書操作，根據Gene Bank提供ABO基因序列信息（NG_006669.1）設計ABO基因第1至第7外顯子擴增引物，引物同擴增測序引物。對樣本ABO基因外顯子進行E6E7 PCR擴增后，采用2.5%瓊脂糖凝膠對其進行擴增產物的鑒定，產物條帶確定后根據其亮度，進行其基因測序；測序采用Sanger法。

1.3.4FUT1、FUT2基因測序：嚴格按照人類H血型系統基因分型檢測試劑盒說明書操作，PCR擴增條件：95 ℃變性2 min，93 ℃變性35 s、60 ℃退火40 s、72 ℃延伸1.5 min，循環36次，最后72 ℃延伸10 min，冷卻到4 ℃。采用Sanger法測序。

1.3.5 結果判定基因型：采用Chromas Version 2.6.5軟件閱讀測序圖譜，與ABO*A1.01序列 （GeneBank序列號NG006669.1）比較確定其突變位點，根據ISBT網站提供的Names for ABO（ISBT001）blood group alleles v1.1 171023數據庫，綜合結果判定其ABO基因型；根據ISBT提供的Names for H（ISBT 018）Blood Group Alleles文件以綜合結果判定（以FUT1、FUT2為參考序列）。全部委托江蘇偉禾生物科技有限公司進行技術測序服務。

2 結果

2.1 血清學結果 先證者正定型A抗原凝集1+、其女兒正定型O型，反定型均為A型，通過吸收放散試驗證實紅細胞上存在A抗原，唾液和凝集抑制試驗提示先證者分泌型，A和H物質陽性，結合血清學檢測結果推測血型為Amh型；其妻子血清學檢測為A型，非類孟買型。見表1。

表1 先證者及家系ABO血型血清學檢測結果

2.2 ABO基因測序 先證者、妻子及女兒基因型均為ABO*A1.02/O.01.02。

2.3FUT1、FUT2基因測序 先證者及女兒FUT1：c.551-552delAG（見圖1）、FUT2：c.357C＞T、c.385A＞T（見圖2）。

圖1 先證者和女兒FUT1基因測序結果（c.551-552delAG）

圖2 先證者和女兒FUT2基因測序結果

3 討論

類孟買血型是一種罕見紅細胞表型，發生率低，紅細胞上缺乏H抗原。文獻報道其既具有明顯遺傳異質性，又有一定的分布區域性，在日本、泰國及中國的臺灣、福建、香港、北京、云南拉祜族人群的頻率分別為1～2/300 000、1/5 000、1/8 000、1/8 500、1/15 620、1/102萬、2.2%[1，3]。隨著分子技術的發展，孟買、類孟買血型抗原合成、分泌以及表達等機制逐步深入[2，4-5]。H抗原缺失的分子研究基礎由FUT1基因突變引起[6-8]。根據dbRBCBGMT發布的數據和相關文獻報道[9]，目前已發現60多種FUT1基因，基因異常包含缺失、插入突變和錯義突變等，且大部分都是錯義突變。

KELLY等[10]在1994年第一次報道孟買、類孟買血型的分子機制。據統計報道[1]，與紅細胞H抗原缺陷相關FUT1最常見變異為FUT1*01N.06（c.551_552delAG）、FUT1*01N.13（c.881_882delTT）和FUT1*01W.09（c.658C＞T）；FUT2等位基因以FUT2*01和FUT2*09基因存在，以c.357C＞T與c.716 G＞A變異；類孟買血型基因缺陷FUT1基因和正常或表達弱FUT2基因，其H抗原強弱決定變異型α-1，2-巖藻糖轉移酶活性強弱，反應其紅細胞（或不）與抗A抗B抗體發生凝集現象，或其通過吸收放散試驗檢測出A或B抗原，但也有報道不能檢出[11]。國內相關文獻[12-13]報道類孟買血型最常見單體型為547-552delAG，其導致的移碼變異引起氨基酸多肽鏈提前終止在268位，最終使α-1，2-巖藻糖基轉移酶失去活性不能合成H抗原。本例先證者血清學發現血型結果凝集減弱，H抗原陰性，紅細胞吸收放散試驗檢出A抗原，ABO基因分型A02，通過基因測序發現FUT1c.551-552delAG，導致p.Glu184Valfs*85突變，FUT2c.357C＞和c.385A＞T突變，該突變在參考數據庫中雖尚未公布，但文獻中偶有報道含c.357C＞T、c.385A＞T位點個體為分泌型。本研究的基因分型與血清學兩者結果相互驗證確認先證者為類孟買血型，其妻子為正常的O型，女兒血型同先證者，根據家系分析先證者的血型及基因突變遺傳給其女兒。

類孟買血型確認目前主要依據血型血清學實驗，其血清學特點：紅細胞上有弱A、B抗原，可通過吸收放散實驗檢出，與抗-H試劑不凝集反應，部分有抗-H、抗-HI或兩者皆有的抗體。為防止類孟買血型漏檢，在平常疑難血型鑒定中可增加抗-H血型試劑使用，輸血首選自體輸血或同型輸血，如無血源，切實考慮抗-A、抗-B和抗-HI是否存在，可選擇37 ℃與供血者無反應的ABO同型紅細胞輸注，最大限度減少溶血存在的風險，如緊急搶救沒有同型血液需要輸注O型懸浮紅細胞時，采用鹽水法和抗人球蛋白法配血均相合血液，以防止抗-H引起輸血反應[14]。先進的分子生物學技術有助于幫助類孟買型患者準確鑒定血型，能夠佐證補充血清學檢驗結果，家系成員結果分析對該類患者遺傳機制及后續精準輸血具有重要的臨床意義[15]。