環(huán)狀RNA CDR1as在乳腺癌中的表達及其臨床意義

薛迪新，徐鈺，陳積賢，陳澄亮，賀新偉，梁美珍，吳偉力

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江 溫州 325200，1.甲乳外科；2. 血液內(nèi)科

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率在我國呈逐年上升趨勢。乳腺癌一旦發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后將變差，如發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，治療困難。目前乳腺癌轉(zhuǎn)移的確切機制仍不清楚，深入研究乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找侵襲和轉(zhuǎn)移過程中關(guān)鍵的分子，對治療及改善乳腺癌患者的預(yù)后有極其重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中存在一種異常表達的非編碼circRNA CDR1as，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[1-2]。在許多實體瘤中發(fā)現(xiàn)circRNA CDR1as參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，比如黑色素瘤、非小細胞肺癌[3-4]，而在乳腺癌組織中，研究也發(fā)現(xiàn)circRNA CDR1as表達升高[5]，目前相關(guān)文獻鮮有報道circRNA CDR1as是否參與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，本研究將探討circRNA CDR1as在乳腺癌中的表達及臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院甲乳外科2018年6月至2019年9月手術(shù)切除的97例乳腺癌患者的癌組織及其距離癌組織2 cm的癌旁正常乳腺組織，所有患者術(shù)前均未進行放化療及內(nèi)分泌治療，術(shù)中將標本迅速放入液氮中速凍，然后保存在-80 ℃冰箱中用于RNA的提取。乳腺癌的TNM分期根據(jù)2017年美國癌癥聯(lián)合委員會乳腺癌分期（第八版）。97例乳腺癌患者均為女性，其中乳腺導(dǎo)管原位癌10例，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌87例。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會同意并批準。

1.2 方法 采用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）進行RNA提取，取約60 mg的組織塊直接放入研體中，加入少量液氮，迅速研磨，加入TRIzol試劑，并用1.5%瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性。反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScriptTMRT試劑盒（日本Takara公司），反應(yīng)條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。RT-qPCR采用SYBR?Premix Ex TaqTMII（日本TaKaRa 公司），20 μL體系參照說明書，反應(yīng)條件如下： 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)，所有實驗重復(fù)3次，以β-actin為內(nèi)參。RT-qPCR的引物序列具體如下：circRNA CDR1as正向引物5’-GAAA ATCCACATCTTCCAGACAA-3’，circRNA CDR1as反向引物5’-GAAGACATGGATATTGAGCCAGT-3’，β-actin正向引物5’-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’，β-actin反向引物5’-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CircRNA CDR1as在乳腺癌組織中的表達 研究結(jié)果顯示，在97例乳腺癌組織中，circRNA CDR1as的相對表達量為1.217±0.609；而癌旁的正常乳腺組織中circRNA CDR1as的相對表達量為0.703±0.532，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示在乳腺癌組織中，circRNA CDR1as的表達升高。

2.2 CircRNA CDR1as在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達 在97例乳腺癌組織中，導(dǎo)管原位癌為10例，浸潤性導(dǎo)管癌為87例。在乳腺導(dǎo)管原位癌中，circRNA CDR1as的相對表達量為0.711±0.332，而在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中circRNA CDR1as的相對表達量為1.278±0.608，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 CircRNA CDR1as表達與浸潤性癌臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果顯示，circRNA CDR1as在不同乳腺癌的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 CircRNA CDR1as的表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

circRNA是一種非編碼RNA，一般通過海綿吸附微小RNA來發(fā)揮生物學(xué)功能。大量研究表明，在許多實體腫瘤中circRNA出現(xiàn)異常表達，同時研究顯示異常表達的circRNA調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移。SONG等[6]研究顯示，在宮頸癌中hsa_ circRNA_101996表達升高，升高的hsa_circRNA_ 101996通過下調(diào)miR-8075的表達激活TPX2基因的表達，從而促進宮頸癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。XU等[7]研究顯示，在卵巢癌中，circRNA-UBAP2表達升高，升高的circRNA-UBAP2通過調(diào)控miR-382-5p/PRPF8，來促進卵巢癌細胞的增殖和凋亡。DENG等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在大腸癌中，circRNA_0001946表達升高，升高的circRNA_0001946通過調(diào)控microRNA-135a-5p的表達促進細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition, EMT），從而促進大腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。而在乳腺癌中，同樣發(fā)現(xiàn)許多異常表達的circRNA，參與癌細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移[9-11]。

在腫瘤細胞中circRNA的異常表達，可通過使腫瘤細胞發(fā)生EMT，促進腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。REN等[12]研究顯示，在肝癌組織及細胞中，hsa_circ_ 0011946表達升高，沉默hsa_circ_0011946表達可抑制癌細胞EMT的過程，使肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移受到抑制。在食管鱗狀細胞癌中，hsa_circ_0012563表達升高，通過沉默hsa_circ_0012563表達可抑制癌細胞EMT的進程，使食管癌鱗狀細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移受到抑制[13]。而在非小細胞肺癌[14]、胃癌[15]、惡性膠質(zhì)瘤[16]中異常表達的circRNA也與腫瘤細胞的EMT有關(guān)。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)circRNA CDR1as在許多實體瘤中表達異常，并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。ZHANG 等[17]研究表明，在非小細胞肺癌細胞中，通過過表達circRNA CDR1as，可促進癌細胞增殖，而敲除circRNA CDR1as的表達，則會誘導(dǎo)癌細胞的凋亡。LI等[4]同樣研究非小細胞肺癌發(fā)現(xiàn)在癌組織中 circRNA CDR1as表達升高，通過沉默circRNA CDR1as的表達，明顯抑制癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，促進癌細胞的凋亡，進一步研究顯示，circRNA CDR1as可通過調(diào)控miR-219a-5p/SOX5軸發(fā)揮上述的致癌機制。TANG等[18]研究顯示，circRNA CDR1as在大腸癌組織中表達升高，升高的circRNA CDR1as與大腸癌的腫瘤的大小、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。YANG等[5]研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中，circRNA CDR1as表達升高，通過沉默RNA CDR1as的表達，來上調(diào)miR-7的表達，從而下調(diào)REGγ基因的表達，使耐藥的乳腺癌細胞對藥物的敏感性增強。

本研究結(jié)果顯示，與癌旁正常的乳腺組織相比，乳腺癌組織中circRNA CDR1as表達升高，與YANG等[5]的研究結(jié)果相似。在收集的97例乳腺癌組織中，導(dǎo)管原位癌為10例，浸潤性導(dǎo)管癌為87例，與導(dǎo)管原位癌相比，在浸潤性導(dǎo)管癌中circRNA CDR1as表達升高。

進一步分析87例浸潤性導(dǎo)管癌中circRNA CDR1as的表達情況與臨床病理特征的關(guān)系，研究結(jié)果顯示，circRNA CDR1as在浸潤性導(dǎo)管癌中的表達在不同乳腺癌的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期有差異，提示circRNA CDR1as與乳腺癌的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期有關(guān)，后續(xù)還需進一步研究。