長期高鹽飲食對小鼠血糖及糞便代謝產物的影響

謝偉，鄭巨佳，李芩耀，甘靜，林灼鋒

1.溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬第二醫院 腎內科，浙江 溫州 325027

糖尿病是由多因素引發的一種慢性代謝性疾病，調查顯示，中國糖尿病的估計患病率從2013年的10.9%增加到2018年的12.4%，而糖尿病前期的估計患病率從2013年的35.7%增加到2018年的38.1%[1]。糖尿病與腎衰竭、失明、心血管疾病、非酒精性脂肪性肝病密切相關[2]。研究發現，除高糖高脂飲食能誘導動物形成糖尿病外，長期高鹽飲食也會對血糖造成影響[3-4]。盡管食鹽作為一種必不可少的調味品有助于提高飲食的愉悅度和滿意度，但許多指南都推薦糖尿病患者進行食鹽限制[5-6]，膳食鈉攝入量與普通人群的血壓升高呈正相關[7]，且高鈉飲食是中風和心血管疾病的既定風險因素[8]。 然而，膳食鹽和葡萄糖穩態之間的聯系仍不清楚，且沒有像高血壓那樣受到重視。大多數飲食干預并不關注鹽/鈉攝入量與糖尿病之間的關系。基于糖尿病的危害性，我們亟需對高鹽誘導糖尿病的機制進行研究。因此我們假設“鹽/腸道代謝物/高血糖”三者存在某種聯系，腸道代謝物可能在高鹽飲食小鼠高血糖進程中具有重要作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物：取8只8周齡的雄性C57BL/6J野生型小鼠，分成高鹽組（HSD組）和對照組（NSD組），每組4只。HSD組給予高鹽飼料（含8% NaCl），NSD組給予普通飼料（含0.5% NaCl），干預22周。小鼠由溫州醫科大學實驗動物中心提供，SPF級環境飼養，室溫（22±1）℃，濕度（50±10）℃，自由攝食飲水。

1.1.2 主要儀器及試劑：全自動樣品快速研磨儀（JXFSTPRP-24/32，上海凈信實業發展有限公司），臺式高速冷凍離心機（TGL-16MS，上海盧湘儀離心機儀器有限公司），高分辨質譜儀（AB Triple TOF 5600，美國AB SCIEX公司），高效液相色譜儀（Waters ACQUITY UPLC，北京國譜科技有限公司），色譜柱[Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），北京國譜科技有限公司]。甲醇、甲酸（德國CNW Technologies公司），純水、乙腈（上海生工生物工程股份有限公司），LysoPC17:0（美國Avant公司）。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖耐受實驗（glucose tolerance test,GTT）：小鼠禁食16 h后，在其尾巴末端1～2 mm處取血，測定空腹血糖（fasting plasma gulcose,FPG），記該時刻為0 min。讓小鼠適應30 min之后，用0.9%的NaCl配置20%的葡糖糖溶液，按0.01 mL/g 的劑量進行腹腔注射并開始計時。在10、20、30、45、60、75、90 min時檢測血糖值并記錄。

1.2.2 胰島素耐受實驗（insulin tolerance test,ITT）：小鼠禁食16 h后，尾巴末端1～2 mm處剪一刀取血，滴血測定FPG，記該時刻為0 min。讓小鼠適應30 min之后，按0.5 U/kg的胰島素劑量對小鼠進行腹腔注射并開始計時。在15、30、45、60、90 min 時檢測血糖值并記錄。

1.2.3 小鼠尾動脈血壓測定：采用BP2000儀器通過尾套法測定小鼠尾動脈血壓，每天在同一時間點將小鼠放入儀器進行測量，使其熟悉檢測環境，減少環境因素的影響。干預第22周時檢測小鼠尾動脈血壓并記錄。每只小鼠測量5組數據，取平均值。

1.2.4 實驗動物處理：干預22周后稱量小鼠體質量，用1%戊巴比妥（0.1 mL/10 g）進行麻醉，處死小鼠。用75%乙醇消毒胸毛，輕輕剪開胸部表皮，在二、三肋間進行心臟取血，并在4 ℃，3 000 r/min離心10 min，并將血清分裝于-80 ℃保存。取血后，剪開胸腔，用0.9%的NaCl對小鼠進行左心室灌流后，取下并稱量小鼠的心、肝、腎、皮下脂肪、附睪脂肪、腎周脂肪和褐色脂肪組織，并在無菌條件下取出腸道糞便，所有組織分裝后于-80 ℃保存。

1.2.5 糞便樣本預處理：將-80 ℃凍存的糞便解凍， 各樣本稱取60 mg，置于1.5 mL EP管中，加入20 μL 甲醇配置的內標（L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL； Lyso PC17:0，0.01 mg/mL），加入600 μL的甲醇水溶液（體積比：CH3OH:H2O=4:1）。加入2個干凈小磁珠，-20 ℃預冷2 min，60 Hz研磨2 min，冰水浴中超聲提取10 min，-20 ℃靜置30 min，4 ℃、13 000 r/min 離心10 min。取200 μL上清液，過濾后移至進樣瓶。另從8個樣本的提取液中等體積提取液體混勻制備質控樣本（QC），控制QC進樣量與樣本進樣量相同。

1.2.6 液相色譜-質譜（liquid chranatography-mass spectrometry, LC-MS）分析：采用超高效液相串聯AB Sciex Triple TOF 5600高分辨質譜儀組成的液質聯用系統進行實驗。采用色譜柱分析糞便標本；柱溫為45 ℃；流動相組成：A-0.1%甲酸水溶液，B-乙腈/甲醇（2/3）（v/v）（含0.1%甲酸）；流速為 0.3 mL/min；進樣體積為5 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.7 代謝組學數據分析：樣本經LC-MS分析后，采用UNIFI 1.8.1軟件用于原始數據的采集，數據預處理在進行模式識別之前，原始數據經代謝組學處理軟件Progenesis QI v2.3軟件（英國Nonlinear Dynamics公司）進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化。使用SIMCA軟件對數據進行處理和自動建模分析，模式識別采用PCA分析。化合物的鑒定基于精確質量數、二級碎片以及同位素分布，使用HMDB和Lipidmaps（v2.3）以及METLIN等數據庫鑒定潛在標志物。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS24.0軟件進行分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。GTT和ITT實驗的曲線下面積（area under curve，AUC）根據公式計算：AUC=0.5×（血糖 0 min+血糖30 min）/2+0.5×（血糖30 min+血糖60 min）/2+1×（血糖60 min+血糖90 min）/2。在代謝組學分析中，同時采用多元變量統計模型的變量權重（variable important in projection, VIP）值和單變量統計t檢驗的P值來篩選差異代謝物。采用多元統計分析結果中的VIP值來衡量各代謝物的表達情況對各組樣本分類判別的影響強度，篩出組間的差異代謝物，VIP＞1的代謝物被認為是差異代謝物。在單變量統計分析中，用t檢驗和變異倍數（fold change, FC）分析來篩選2組之間的差異代謝產物，以FC＞2.0且P＜0.05作為篩選標準。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 長期高鹽飲食對小鼠機體組分的影響 長期高鹽飲食可顯著抑制雄性C57BL/6J小鼠體質量增加（P＜0.05），同時顯著增加小鼠心臟、腎臟比重 （P＜0.05），但小鼠的皮下脂肪、附睪脂肪、腎周脂肪及棕色脂肪比重顯著降低（P＜0.01），而對小鼠肝臟比重無影響（P＞0.05），見表2。

表2 長期高鹽飲食對各組小鼠機體組分的影響（每組n=4）

2.2 長期高鹽飲食對小鼠血糖代謝及血壓的影響 與NSD組相比，HSD組收縮壓顯著升高（P＜0.01）；舒張壓差異無統計學意義（P＞0.05）；HSD組FPG顯著升高（P＜0.05）；GTT曲線結果顯示，HSD組AUC值明顯高于NSD組，且HSD組血糖峰值顯著大于NSD組（P＜0.05）；ITT曲線結果顯示，2組的AUC值差異無統計學意義。見圖1。

圖1 長期高鹽飲食可升高小鼠血糖及血壓

2.3 長期高鹽飲食對小鼠糞便代謝組學的影響

2.3.1 質控結果：采用LC-MS檢測分析每個樣品，得到兩個原始質譜文件（正離子模式和負離子模式）。QC樣本正負離子檢測模式下的每組樣品的質譜總離子流圖出峰保留時間和峰面積重疊均較好，提示儀器穩定。

2.3.2 模式識別結果：各組血清樣本分布PCA得分總體較清晰（見圖2），表明各組代謝表型差異較明顯。

圖2 NSD組、HSD組及QC樣本的PCA分析

2.3.3 長期高鹽飲食干預后差異代謝物：根據差異代謝物的精確相對分子質量和二級質譜圖鑒定差異代謝物，鑒定出12種差異代謝物包括：3-羥基辛烷基肉堿（3-hydroxyoctanoyl carnitine）、2-辛烯酸（2-otenedioic acid, 2-octenoate）、地紅霉素（drithromycin）、NBD-硬脂酰-2-花生四烯醇-sn-甘油（NBD-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol）、20-乙基-前列腺素E2（20-ethyl-PGE2）、甜菊苷（stevioside）、雙哌啶（biperiden）、lysyl-蛋氨酸（lysyl-Methionine）、去甲膽酸（norcholic acid）、三萜醇黃皮萜醇（lansiol）、7，8，7’，8’-四脫氫黃質（7，8，7’，8’-tetradehydroastaxanthin）、磷脂酰甘油磷酸甲酯（PGP-Me），見表3，各個差異代謝物在各組中的峰面積變化見圖3。HSD組小鼠糞便中的地紅霉素、NBD-硬脂酰-2-花生四烯醇-sn-甘油、20-乙基-前列腺素E2、雙哌啶、去甲膽酸、三萜醇黃皮萜醇及磷脂酰甘油磷酸甲酯代謝物含量高于NSD組，差異有統計學意義（P＜0.05）；HSD組小鼠糞便中的3-羥基辛烷基肉堿、2-辛烯酸、甜菊苷、lysyl-蛋氨酸及7，8，7’，8’-四脫氫黃質代謝物含量低于NSD組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 2組小鼠12種差異代謝物的峰面積變化

表3 長期高鹽飲食干預后差異代謝物鑒定結果

3 討論

研究發現，甜菊苷、黃連素、姜黃素和辣椒素等多種天然分子對胰腺β細胞具有再生和抗凋亡作用，還可通過刺激胰腺β細胞來增加胰島素分泌[9]。甜菊苷除了具有降低血糖、促進胰島素分泌、改善胰島素抵抗等功效外，還具有降低血壓的作用[10]。體內外研究發現甜菊糖苷可通過增加葡萄糖轉運體4（glucose transporter 4, GLUT4）的合成，有效促進糖尿病肌肉中的葡萄糖攝取（glucose uptake,GU）和氧化，其方式與二甲雙胍類似[10]。機制上講，甜菊糖苷與胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1, IRS-1）和GLUT4的結合親和力較高。甜菊糖苷通過激活IR/IRS-1/Akt/GLUT4通路，有效抑制氧化應激，促進糖尿病腓腸肌GU。甜菊醇和甜菊苷在糖尿病誘導的L6和3T3L1細胞中表現出胰島素模擬特性的分子證據[11]。甜菊糖苷被認為是一種很有前途的治療2型糖尿病的植物藥物[10，12]。經過PCA分析，結合圖譜表明，與對照組相比，高鹽飲食小鼠體內甜菊苷代謝物的含量明顯降低。結合以上研究基礎，推斷高鹽的攝入可能影響著甜菊苷的吸收，進而影響了血糖，導致GTT值升高。

氨基酸失衡與高血壓及其并發癥關系密切。除低鈉低膽固醇飲食外，適當增加攝入同型半胱氨酸的前體物質蛋氨酸，對減輕體質量，降低血壓、血糖、血脂，抗脂質過氧化，預防動脈硬化均有益處，而高水平的蛋氨酸攝入會產生不良反應，如高同型半胱氨酸血癥、體質量下降和膽固醇水平升高，因此，安全劑量的蛋氨酸具有一定的藥用價值[13]。在糖尿病中，高硫氨基酸（包括蛋氨酸和半胱氨酸）飲食與糖尿病死亡風險的增加有關，而將攝入量降低至推薦膳食允許水平可導致終生風險的降低[14]。在1型糖尿病大鼠中，給予L-蛋氨酸喂養8周，可顯著改善血糖和胰島素水平，下調胰高血糖素和Bax表達。適當補充蛋氨酸是一種減輕糖尿病誘導的β細胞死亡的新治療方法[15]。在其他疾病方面，有學者認為限制蛋白質和蛋氨酸攝入可改善健康和衰老代謝相關的神經退行性疾病，并可能與成纖維細胞生長因子21、mTOR和自噬有關，改善線粒體功能和氧化應激[16]。本研究中，小鼠GTT值較對照組顯著升高，蛋氨酸含量顯著下調，推測高鹽飲食可能改變了腸道微生態，從而干擾了小鼠對氨基酸物質如蛋氨酸的吸收，高鹽飲食條件下，適當增加蛋氨酸的攝入是否能夠改善小鼠血糖及糖耐量情況，值得進一步探討。

胰島中前列腺素E（prostaglandin E, PGE）是花生四烯酸的代謝產物，主要由4種特異的膜G蛋白偶聯前列腺素E受體亞型（EP1、EP2、EP3和EP4）調控發揮生物作用[17]。PGE產量的增加和EP3的表達是導致2型糖尿病β細胞功能障礙的重要因素。然而，肥胖中存在許多相同的病理生理條件，而關于PGE的產生和信號傳導途徑如何影響非糖尿病β細胞的功能，目前知之甚少。研究表明，白細胞介素-6（interleukin-6, IL-6）和環氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）mRNA水平與人體體質量指數（body mass index, BMI）呈正相關，而EP3 mRNA水平也與BMI呈正相關。此外，IL-6的表達也與COX-2等PGE合成途徑基因的表達密切相關。使用EP3特異性拮抗劑的胰島素分泌測試證實了PGE產生的功能相關上調，胰島素含量隨供體BMI和胰島COX-2表達量的增加而增加，而EP3表達量則不受影響[18]。與非糖尿病對照組相比，從動物或人類器官供體分離的小鼠和人類胰島中，胰島EP3和PGE合成酶的表達和（或）PGE排泄本身都出現上調。2型糖尿病小鼠的全身代謝參數的改變與EP3介導的β細胞功能障礙的改善相關[19]。推測胰島PGE生成上調可能是胰島β細胞對肥胖和胰島素抵抗的適應反應的一部分，只有當配體和受體在2型糖尿病中都高表達時才會功能失調。綜上研究，在給予小鼠長期高鹽飲食后，小鼠GTT值較對照組顯著升高，PGE2含量顯著上調，推測高鹽飲食顯著增加了雄性C57BL/6J小鼠的胰島PGE對鹽負荷的反應。

有學者認為2型糖尿病患者的血糖與血鈉存在密切關系，高鹽的攝入可能影響著葡萄糖的吸收，進而影響血糖值[20]。體外實驗發現，高鹽溶液刺激胰島Min6細胞后能顯著抑制其胰島素分泌功能[21]。 體內研究發現，大鼠給予高鹽飲食3周后，即可發現血糖升高[22]。臨床研究發現，長期高鹽飲食能增加糖尿病的患病率[23]，且高鹽攝入是一項糖尿病發生的獨立危險因素[24]。機制上，高鹽飲食可能是通過腎臟皮質近端小管上皮細胞的鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2調節血糖穩態，誘導糖尿病[25]。血糖的升高也可能與高鹽飲食條件下的腸道中鈉-葡萄糖協同轉運蛋白1表達升高有關[26]。既往研究表明，體內棕色脂肪的含量增多或活性增加可以減輕胰島素抵抗及體內炎癥情況[27]，而本研究中，鹽負荷小鼠皮下脂肪、附睪脂肪、腎周脂肪及棕色脂肪比重顯著降低，因此，小鼠血糖的升高跟鹽負荷后小鼠皮下棕色脂肪的減少可能存在某種關聯。通過LCMS代謝組學方法，我們初步觀察到長期高鹽飲食小鼠發生高血糖的原因可能與鹽負荷后出現的氨基酸代謝、胰島中前列腺素代謝及氧化應激炎癥等調控失衡有關。此外，其他差異代謝物如3-羥基辛烷基肉堿、2-辛烯酸、7，8，7’，8’-四脫氫黃質、NBD-硬脂酰-2-花生四烯醇-sn-甘油等，目前尚未明確其對人體的作用機制，需后續的繼續關注與研究。

總之，本研究結果發現雄性C57BL/6J小鼠在鹽負荷后，體質量減輕，心臟、腎臟比重顯著增加，但皮下脂肪、附睪脂肪、腎周脂肪及棕色脂肪比重顯著降低，血糖及血壓均顯著升高，糞便代謝組學結果顯示高鹽飲食小鼠存在氨基酸代謝、胰島中前列腺素代謝及氧化應激炎癥等過程調控失衡，提示鹽負荷后高血糖形成機制錯綜復雜，有待于今后進一步深入研究。