繼代次數對天津七里海野生珍稀葦蘑菌種的活性影響*

劉西周

（天津師范大學生命科學學院，天津 300387）

天津七里海位于中國天津市寧河區，屬于典型濱海地帶沼澤濕地類型，是具有古代中國海岸地貌特征的大型濕地之一。七里海天然濕地自然生態資源多樣性豐富，但由于環境變化和人類活動的雙重影響，如今七里海沿岸的濕地正在嚴重萎縮[1-2]。近年來，由于自然因素和無節制地采摘等人為因素，該域內野生葦蘑的產量和品質逐年下降，野生葦蘑幾乎絕跡。

為保護葦蘑種質資源，從七里海地區采集到野生葦蘑菌株，經初步鑒定其為擬蠟傘科（Hygrophoropsidaceae）擬蠟傘屬 （Hygrophoropsis）。經查閱國內外相關資料，目前有關葦蘑的報道有葦蘑多糖提取工藝研究[3]、抗氧化作用研究[4]、分類學研究[5]、液體培養基優化[6-8]、人工馴化等[9]，但尚未發現其繼代次數對菌種活性影響的相關報道。葦蘑作為天津七里海地區特色的菌物資源，對其進行馴化、栽培研究具有極大的應用前景，且生態效益和經濟效益顯著。因此，通過探究葦蘑不同繼代次數對菌種活性的影響，為保護菌種資源、恢復天津七里海濕地生態系統物種多樣性提供科學依據，同時對葦蘑的進一步研究以及實現葦蘑合理、有序地開發和利用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

葦蘑（Hygrophoropsis sp.）菌株，保藏于天津師范大學蕈菌研究所。

1.1.2 培養基及試劑

1）PDA綜合培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、VB110 mg、硫酸鎂1.5 g、磷酸二氫鉀3 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

2）培養料配方：稻草52%、麥粒24%、蘆葦腐殖質24%[9]。

3）染色劑：吉姆薩染色液。

1.2 試驗方法

1.2.1 葦蘑菌種繼代培養

葦蘑子實體組織分離獲得的菌種標記為第1代，接種到PDA綜合培養基上，于25℃培養。選取葦蘑菌落邊緣生長部位，使用無菌槍頭打孔，接種至PDA綜合培養基上，進行繼代培養。每代接種8個平板，連續從第1代傳至第10代。

1.2.2 栽培種制作

選取2 cm～4 cm稻草段，浸水12 h進行預濕，然后瀝干水分；麥粒浸泡24 h后預煮至透明無白芯；選擇無雜質的蘆葦腐殖質，過篩（孔徑3 mm）備用。

按培養料配方進行稱料，將預濕后的稻草、煮好的麥粒、蘆葦腐殖質進行混勻拌料，調整培養料含水量約為56%；然后裝入聚丙烯袋（300 mm×150 mm×0.05 mm），濕重150 g，于121℃滅菌2 h；冷卻后接種，每代接20袋。

1.2.3 葦蘑菌落特征的比較與分析

1）菌落直徑大小

自每代菌種轉接至新平板培養開始，每隔1天用卡尺按“十”字交叉法測出固體培養基中菌落直徑，并拍照記錄；繪制各代菌落生長折線圖，比較和分析不同繼代次數菌落大小的差異與成因。

2）菌絲稀疏程度比較與分析

自每一代菌種轉接至新平板培養開始，觀察菌絲稀疏程度以及老化（褐化）出現時間，并拍照記錄。

3）菌種老化（褐化）時間比較與分析

觀察、記錄菌落出現色素沉積（褐化）的時間并拍照，比較和分析不同繼代次數菌種老化程度與形成原因。

4）菌種退化程度與分析

觀察記錄菌落出現停止生長與退行性生長的時間并拍照。5）不同繼代次數葦蘑菌種菌絲特征比較與分析觀察、記錄不同繼代次數葦蘑菌種菌絲特征，分析形成原因。

1.2.4 不同繼代次數葦蘑栽培種生長情況對比

無菌條件下分別將不同繼代次數的菌種進行栽培種培養基接種，接種塊為1 cm2，于25℃黑暗條件培養；觀察并記錄不同菌種萌發與菌絲體長勢，滿袋與否及抗雜菌能力。

2 結果與分析

2.1 菌落直徑大小比較與分析

第1代～第8代葦蘑菌落生長變化曲線見圖1。

圖1 不同繼代次數葦蘑菌落生長曲線Fig.1 Growth curve of the Hygrophoropsis sp.colony with different subculture times

如圖1所示，第1代～第7代葦蘑菌種菌落總體生長趨勢在0～19 d基本趨同，從第21天起逐漸分化，菌落直徑持續增大；前6代在傳代27天后，所有葦蘑菌落生長遲緩；第8代葦蘑較前7代菌落生長速度極其緩慢，到第11天葦蘑菌落生長明顯變慢，幾乎停滯。前3代培養37天后葦蘑菌落不生長，平均菌落大小（直徑）停留在7.85 cm，由此可見，隨著繼代次數增加，前6代菌落生長接近正常，至第8代菌落生長速度明顯減慢，培養至第11天基本停止生長，說明連續傳代至第8代時，在營養與其他條件滿足的前提下，葦蘑菌種出現斷崖式退化，因此在葦蘑批量化栽培過程中需要嚴格控制傳代次數，以減少不必要的菌種退化。

2.2 菌絲稀疏程度的比較與分析

對比不同繼代次數葦蘑菌種培養13 d的菌絲生長情況，見圖2。

圖2 不同繼代次數葦蘑菌種培養13 d的菌落生長情況Fig.2 Colony growth of the Hygrophoropsis sp.cultured for 13 days with different subculture times

如圖2所示，其菌絲疏密程度隨繼代次數呈逐漸下降趨勢。第1代葦蘑菌絲最密集；第3代葦蘑菌絲密度開始降低；直至第8代菌絲稀疏最明顯，且不再生長，出現斷崖式改變。

不同繼代次數葦蘑的菌絲體密集程度變化見表1。

表1 不同繼代次數葦蘑的菌絲體密集程度Tab.1 The density of mycelium of the Hygrophoropsis sp.with different subculture times

如表1所示，隨著繼代次數增加，菌絲體密集度隨之降低，前3代葦蘑菌絲體較密集，且在培養全過程中變化不大；第4代～第7代菌絲體密集程度降低；從第6代開始，菌絲體密集程度明顯下降，直至第8代最明顯；第8代菌絲體在培養5天后變得稀疏，且相比其他繼代次數，從菌絲體稀疏度和菌絲體呈現稀疏時間都比其他代數提前。正常葦蘑菌種一般情況菌絲體疏密度不會有太大變化，菌絲體稀疏程度與生物量相關，一定程度上反應了菌種活性，可見第8代繼代菌種出現活性驟降，退化明顯，且不可恢復。

2.3 菌種老化時間的比較與分析

不同繼代次數葦蘑菌種老化時間及生長情況，見圖3。

圖3 不同繼代次數下菌種首次出現菌落老化時間Fig.3 The colony aging time appeared for the first time under different subculture times

如圖3所示，第8代葦蘑菌種與其他7代差異最為明顯，菌種生長速度明顯變慢，且在第6天有些菌落變為黃褐色，第9天葦蘑菌落全部變為黑褐色，由于菌絲分泌的褐色素，菌落周圍培養基變為黃色，不同繼代次數葦蘑菌絲體老化程度記錄見表2。

從表2可知，培養9 d～13 d葦蘑菌種老化程度隨繼代次數逐漸增強。第3代葦蘑菌種老化速度明顯變快，且比第4代～第7代的菌絲褐變程度更加嚴重，第3代葦蘑菌種中后期菌落邊緣菌絲體聚集成球狀；第3代葦蘑菌落后期徹底變為黑褐色，PDA綜合培養基內看不到白色菌絲體，葦蘑菌落未長滿培養基，PDA綜合培養基變成深黃色。第4代～第7代葦蘑菌落生長狀況較第3代而言老化速度變慢。每一代菌種培養4 d，菌落中央就開始呈現淺黃色。總體來看，前4代菌種老化均出現在培養25 d～27 d，隨著繼代次數增加老化程度出現時間越來越早，至第8代培養約9 d即出現大面積褐化現象，菌落不再生長，培養至第8代驟然出現菌種老化。

表2 不同繼代次數代葦蘑菌種老化程度Tab.2 The aging degree of Hygrophoropsis sp.culture with different subculture times

2.4 不同繼代次數葦蘑菌種退化程度與分析

以第1代葦蘑為例，不同培養時間的菌落特征見圖4。

圖4 第1代葦蘑不同培養時間菌落特征Fig.4 Colony characteristics of the 1th generation of Hygrophoropsis sp.at different culture time

由圖4可知，第1代葦蘑菌種在PDA綜合培養基上，1 d～5 d菌絲生長狀態良好，菌落呈現白色，菌絲密集并且呈現絨毛狀；11 d菌落中心凹陷，菌落外周菌絲體呈現絨氈狀，菌絲體呈淺黃色，之后逐漸加深；15 d菌落中部呈深黃色，且于中央出現菌核；19 d菌核變大，菌落中央菌絲體密集度增加；培養29 d，菌落中央呈深棕色且顏色向四周逐漸變淺，中央處菌核變大；培養至后期，由于其分泌的褐色素使菌落中央變為黑褐色。而第2代～第8代葦蘑菌落生長趨勢相同，唯一不同是隨著菌種繼代次數的增加，菌落整體生長周期明顯縮短；第1代29 d出現褐化；第6代～第8代主要表現為菌落不生長，且菌落褐化時間提前。經轉板重復驗證，該規律重復出現，可視為菌種的退化。由此可見，菌落老化是外在表現，一定程度上也反映菌種退化的規律；菌落從活性較強到菌絲稀疏，甚至不再生長，說明菌種已經退化，需要重新分離新菌種；且退化現象不可逆，一旦出現無法修復。

2.5 不同繼代次數葦蘑菌絲特征對比

不同繼代次數葦蘑菌絲微觀形態見圖5，菌絲特征量化指標見表3。

圖5 葦蘑菌絲染色結果Fig.5 Mycelial staining results of the Hygrophoropsis sp.

表3 不同繼代次數葦蘑菌絲特征量化指標對比Tab.3 Comparison of quantitative indexes of mycelial characteristics of the Hygrophoropsis sp.with different subculture times

如圖5和表3所示，葦蘑菌絲隨著繼代次數增加菌絲逐漸變細，其中骨架菌絲數量減少且變弱，生殖菌絲數量多和鎖狀聯合有所減少，由此可見菌種老化與退化不僅表現在菌落特征上。從微觀形態觀察其菌絲特征可以明顯看到隨著繼代次數遞增，骨架菌絲和聯絡菌絲的形態與數量基本保持不變，生殖菌絲明顯變少，分支變多，菌絲纖細。

2.6 不同繼代次數葦蘑栽培種生長情況對比

不同繼代次數葦蘑栽培種的菌絲生長情況見表4。

表4 不同繼代次數葦蘑栽培種生長情況Tab.4 Growth of the Hygrophoropsis sp.spawn with different subculture times

由表4可知，第1代葦蘑栽培種菌絲萌發周期約為24 h，之后隨繼代次數增加萌發周期逐漸增加；至第8代需72 h萌發且菌絲基本不吃料，無健壯生長跡象。滿袋時長隨繼代次數增加呈逐漸增加的趨勢，至第7代和第8代開始，長時間不能滿袋。原基數量和抗雜菌能力同樣呈現相同趨勢，這可能是由于菌絲較弱形成不了優勢菌落，雜菌容易侵染。由此可見菌種老化與退化不僅表現在菌落特征和微觀形態，從栽培種的生長情況也可以明顯看到；隨著繼代次數遞增，菌絲萌發活力逐漸降低，甚至不再生長。葦蘑菌絲體在培養料中定植和生長的情況，更直觀地反應了菌絲活性變化規律以及繼代次數。由此可知，在實際生產中應該重視繼代次數，以免造成大面積減產或損失。

3 討論

尋找食用菌的最佳繼代次數有利于食用菌菌種保藏和食用菌規模化生產，通過多次繼代培養的食用菌菌種都會出現退化的現象。不同菌種的老化屬于生理現象，由于菌種的基因型沒有變化，所以并不會遺傳給下一代，但退化現象是可遺傳的。研究表明，繼代培養過程中菌種的繼代次數越多，其菌落大小、生長速率、菌絲的密度均呈下降趨勢；同時菌種開始逐漸退化，退化菌種的菌絲形態要比正常菌絲細弱，且生長速度也遠低于正常菌絲[10-11]。相比正常菌種而言，退化菌種的生長優勢缺失，抗雜菌能力降低；繼代過程中菌落形態發生了明顯變化；同時菌種的遺傳物質也發生了改變[12-13]。蛹蟲草（Cordyceps militaris）繼代培養相關研究表明，隨繼代次數的增加，原基形成數量逐漸變少，形成原基和子實體的時間逐漸延后，生物轉化率降低，品質下降的同時出現畸形菇的概率上升[14]。通過觀察不同繼代次數葦蘑菌種的生長速度、菌落和菌絲形態、栽培種萌發等情況，發現繼代次數對其菌種活性影響較大；繼代培養到第8代時，菌種生長速度變慢，菌絲體密集程度下降，老化程度加深，原基數量減少，退化現象明顯；因此，葦蘑最佳繼代次數應嚴格控制在8代以內，這為葦蘑菌種保藏和批量化生產提供了理論和實踐指導。