紅緣擬層孔菌菌絲的生物學特性研究*

吳龍月，馬水麗，何小芳，蘇琮葆，葉麗云，湯坤鵬，吳小平**

（1.福建農林大學生命科學學院菌物研究中心，福建 福州 350002；2.福建省食用菌技術推廣總站，福建 福州 350003）

紅緣擬層孔菌（Fomitopsis pinicola）隸屬于多孔菌目 （Polyporales）擬層孔菌科 （Fomitopsidaceae）擬層孔菌屬（Fomitopsis），是一種木腐菌。菌蓋半圓形或馬蹄狀，菌蓋在生長中顏色由白色變為紅褐色至黑褐色，邊緣從乳白色變為淺黃色或紅褐色[1]。紅緣擬層孔菌是一種藥用價值較高的大型真菌，其味微苦、性平，具有補肺益腎、安神定志、扶正培本、滋補強壯和祛風除濕等作用；對腎炎、支氣管炎、癌癥、心臟病、糖尿病等有特效，民間常用于治療“寒腿”病[2-3]。

目前，國內關于紅緣擬層孔菌的研究較少，關于其生物學特性方面的研究更是未見報道，故擬對紅緣擬層孔菌菌絲體的固體培養條件展開初步研究，以期為紅緣擬層孔菌的固體培養和人工馴化提供借鑒的依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

紅緣擬層孔菌菌種，由福建農林大學生命科學學院菌物研究中心菌種保藏中心提供。

1.2 試劑與儀器

葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、甘露醇、麥芽糖、糊精、蛋白胨、尿素、牛肉膏、酵母粉、硝酸銨、干酪素和磷酸氫二銨均為國產分析純。

SPX-250B-Z恒溫培養箱，上海博迅實業有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.3 培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然。

碳源試驗培養基、氮源試驗培養基、pH試驗培養基、溫度試驗培養基和正交試驗培養基，則均參照參考文獻[4]和參考文獻[5]的方法配制。

1.4 紅緣擬層孔菌的生物學特性研究

1.4.l 碳源試驗

參照張峰等[3]的研究方法，以PDA培養基為基礎，分別選用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、甘露醇、麥芽糖和糊精作為碳源進行試驗。將活化的紅緣擬層孔菌菌種分別接種于各種碳源培養基中，以不添加碳源的培養基作為對照，置25℃恒溫培養箱中培養，每處理5個重復。接種后，每間隔24 h觀察一次菌落特征和菌絲長勢，其中菌絲長勢根據菌落特征和菌絲生長速率綜合判斷；采用“十”字交叉法精確測量菌落直徑，計算菌絲日生長速度并進行方差分析，每處理重復 5 次[6-9]。

1.4.2 氮源試驗

以上述的PDA培養基為基礎，分別選用蛋白胨、尿素、牛肉膏、酵母粉、硝酸銨、干酪素和磷酸氫二銨作為氮源進行試驗。將活化的紅緣擬層孔菌菌株接種于各種氮源培養基中，以不添加氮源的培養基作為對照，置25℃恒溫培養箱中培養，每處理5個重復。記錄方法同1.4.1。

1.4.3 pH試驗

配制pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的pH試驗培養基（培養基滅菌后用滅過菌的1 mol·L-1NaOH和l mol·L-1HCl調節pH）。將活化的紅緣擬層孔菌菌株接種于這5種不同pH的培養基中，置25℃恒溫培養箱中培養，每處理5個重復。記錄方法同1.4.1。

計算機主要由硬件和軟件兩大部分組成。計算機的硬件設備構成了計算機的外殼(包括輸入輸出設備、存儲設備、運算設備和控制設備)，軟件(包括系統軟件、通用軟件和應用軟件)則是支持計算機運行的內部構件，計算機語言編程的正是這些軟件。計算機的具體組成可以參照圖1。

1.4.4 溫度試驗

將活化的紅緣擬層孔菌菌株接種于溫度試驗培養基中，將接種后的平板分別置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃的恒溫培養箱中培養，每處理5個重復。記錄方法同1.4.1。

1.4.5 正交試驗

依據碳源、氮源、pH和溫度的單因素試驗結果，選擇這4個因素中最優的3個水平進行4因素3水平的正交試驗，設計方案見表1。

表1 影響紅緣擬層孔菌菌絲生長的因素水平設計Tab.1 Design of factors and levels affecting mycelial growth of Fomitopsis pinicola

如表1所示進行試驗，記錄方法同1.4.1。

1.5 數據統計與分析

試驗數據以平均值表示，采用SPSS 20.0軟件對試驗數據進行分析，以P<0.05和P<0.01分別表示不同處理間的顯著差異和極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 紅緣擬層孔菌的生物學特性

2.1.1 碳源試驗

不同碳源對菌絲生長的影響試驗結果見表2。

表2 不同碳源對菌絲生長的影響Tab.2 Effects of different carbon sources on mycelial growth of Fomitopsis pinicola

2.1.2 氮源試驗

氮源主要用于機體內含氮化合物的合成，不同氮源對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響試驗結果見表3。

表3 不同氮源對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響Tab.3 Effects of different nitrogen sources on mycelial growth of Fomitopsis pinicola

由表3可知，紅緣擬層孔菌在不含氮源的培養基上無法生長，不同氮源培養基對紅緣擬層孔菌菌絲體生長的影響不同。其中在以酵母粉作為氮源時，紅緣擬層孔菌菌絲較密，生長速度最快，長勢最好；在以磷酸氫二銨為氮源的培養基上菌絲生長速率快但菌絲稀疏；另外在以蛋白胨、尿素、牛肉膏和硝酸銨為氮源的培養基上，菌絲長勢一般；而在以干酪素為氮源的培養基中，菌絲較稀疏且生長緩慢。因此，最終選擇以酵母粉、牛肉膏和磷酸氫二銨為氮源進行正交試驗。

2.1.3 pH試驗

不同pH對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響試驗結果見表4。

表4 不同pH對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響Tab.4 Effects of different pH on mycelial growth of Fomitopsis pinicola

由表4可知，紅緣擬層孔菌菌絲體生長速率受培養基pH的變化影響較大。pH為5.0和6.0時，紅緣擬層孔菌菌絲長勢強，菌絲濃密，且pH為5.0時菌絲生長速率最快，達到6.36 mm·d-1；當pH為4.0和7.0時，菌絲較密但菌絲長勢一般；隨著pH繼續升高，當pH為8.0時，紅緣擬層孔菌菌絲生長速率最小（2.62 mm·d-1），菌絲長勢最弱。可見紅緣擬層孔菌菌絲生長偏好于酸性環境，因此選擇以pH為4.0，5.0和6.0進行下一步試驗。

2.1.4 溫度試驗

不同溫度對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響試驗結果見表5。

由表5可知，在20℃～40℃的溫度范圍內，隨著培養溫度升高，紅緣擬層孔菌菌絲生長速度呈先增加后降低的趨勢。15℃時菌絲雖密卻長勢弱，生長速度僅為 0.70 mm·d-1；在 20℃、25℃、30℃、35℃培養時，菌絲越來越密，菌絲生長速率也一直在上升；在35℃培養時，菌絲生長速率達到峰值（7.32 mm·d-1），菌絲密，長勢強；而在40℃的培養條件下，菌絲生長速率受高溫影響而完全無法生長。可見培養溫度對會紅緣擬層孔菌的菌絲生長有很大影響，因此選擇以培養溫度為25℃、30℃和35℃進行正交試驗。

表5 不同溫度對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響Tab.5 Elfects of different temperatures on mycelial growth of Fomitopsis pinicola

2.1.5 紅緣擬層孔菌培養條件優化的正交試驗

基于上述單因素試驗結果，從4個因素中各選取較好的3個水平進行正交試驗，通過正交設計助手Ⅱv3.1設計試驗方案進行試驗。試驗結果見表6。

如表6所示，極差（r）最大的是溫度，為2.5；極差從大到小依次表現為溫度、氮源、pH、碳源，說明4因素對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響大小依次為溫度＞氮源＞pH＞碳源。根據正交試驗結果分析，最優組合A3B2C2D1為紅緣擬層孔菌菌絲生長的最適培養條件組合，為以麥芽糖為碳源，酵母粉為氮源，培養基pH為4，培養溫度為30℃。在最適的培養條件下，紅緣擬層孔菌菌絲的生長速度最快，為13.10 mm·d-1。

表6 紅緣擬層孔菌菌絲生長影響因素的正交試驗結果Tab.6 Orthogonal experimental results of factors affecting mycelial growth of Fomitopsis pinicola

對正交試驗結果進行方差分析，結果見表7。

如表7所示，4個因素對紅緣擬層孔菌菌絲生長速率均有顯著影響，其差異顯著性最大的是溫度，其次是氮源、pH、碳源，方差分析的結果與直觀分析結果一致。

表7 正交試驗結果的方差分析Tab.7 Orthogonal experimental results of F-test

3 討論

紅緣擬層孔菌的單因素試驗表明，在碳源為單糖或雙糖時更適合菌絲體生長，這一特性與黃毛黃側耳的生物學特性相一致[10]。在氮源為干酪素和磷酸氫二銨時，則幾乎不能為紅緣擬層孔菌所利用，而在氮源為蛋白胨、尿素、牛肉膏和硝酸銨時，菌絲長勢較好，這可能是因為有機氮源中含有可以促進菌絲生長的成分，如微量元素、核苷酸、維生素等一些非氮成分[4，11]。紅緣擬層孔菌的菌絲生長速率在pH為5.0時生長最快，說明紅緣擬層孔菌偏好在弱酸性環境中生長，這與迷宮栓孔菌ZT-055菌絲體的生物學特性的研究一致[3]。培養溫度試驗表明，35℃時紅緣擬層孔菌長勢最好，生長最快，正交試驗結果也表明，溫度對紅緣擬層孔菌菌絲生長的影響最大，這與郝金斌等[12]的研究一致，屬中高溫性菌。通過試驗得到紅緣擬層孔菌菌絲生長的最適培養條件為：以麥芽糖為碳源、酵母粉為氮源，培養基pH為4，培養溫度為30℃。因培養基滅菌前后pH變化較大，故本次試驗在培養基滅菌后再通過加鹽酸或氫氧化鈉來調整pH。紅緣擬層孔菌的生長速率不高，而本研究中對紅緣擬層孔菌的固體培養與菌種保藏具有指導意義，為紅緣擬層孔菌的人工培養提供了理論依據。