平菇菌株黑平16-1的選育及生物學特性*

孔維麗，崔 筱，劉 芹，胡素娟，宋凱博，王彥坡，吳 杰，張玉亭

（河南省農業科學院植物營養與資源環境研究所，河南 鄭州 450002）

平菇 (Pleurotus ostreatus)又名糙皮側耳，隸屬于擔子菌門（Basidiomycoat）蘑菇綱（Agaricomycetidae）蘑菇目 （Agaricales）側耳科 （Pleurotaceae）側耳屬 （Pleurotus）[1]。平菇是我國第三大品種，年產量686.47萬噸，河南省是平菇生產大省，年產量約115萬噸[2]。2019年我國人均GDP己經突破一萬美元大關[3]，城鄉居民的消費需求不斷變化升級，消費理念大幅改變；食用菌作為健康、綠色食品，受到消費者喜愛，由季節性消費向逐步周年消費轉變，消費結構的轉變促使食用菌由季節性栽培向工廠化周年栽培方式轉變。金針菇（Flammulina velutipes）、杏鮑菇（Pleurotus eryngii）、蟹味菇（Hypsizygus tessellatus）、雙孢蘑菇 （Agaricus bisporus）已經實現工廠化周年化生產。品種是工廠化栽培的關鍵，金針菇、蟹味菇工廠化品種一茬菇的生物學效率達到100%以上[4-5]，平菇工廠化栽培成為近年研究熱點[6-7]。生產中平菇季節性栽培所用的平菇品種一般出三潮～四潮菇，生物學效率達到80%～100%，但生產周期長達6個月，難以滿足工廠化生產方式的需要，因此急需選育出生產周期短，一茬菇生物學效率高，出菇整齊集中，適宜工廠化栽培的平菇新品種。試驗以國審黑色高產平菇菌株P99和黑色野生菌株NY-2為親本，通過單孢雜交的方法選育出適宜工廠化栽培的平菇新品種；該品種在出菇集中，一茬菇生物學效率方面顯著高于生產主栽品種，為平菇工廠化生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株

親本菌株P99，引自中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，保存于河南省食用菌種質資源庫；親本菌株NY-2，于商丘地區野生采集，保存于河南省食用菌種質資源庫。

1.2 培養基

母種培養基為PDA培養基（去皮土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL）。培養料配方為棉籽殼98%，石灰2%。

1.3 方法

1.3.1 孢子收集及單孢分離

孢子收集及單孢分離的方法按照參考文獻[8]。

1）孢子收集

以平菇菌株P99和NY-2為親本，熟料栽培，挑選第一茬朵型圓整、顏色均勻的整朵子實體為種菇，8成～9成熟時采收。取單個菌蓋，菌褶向下置于潔凈干燥的有色紙上，25℃～28℃培養24 h，可見紙面有一層灰白色孢子印。

2）單孢分離

采用一步稀釋法，用接種鏟取0.1 mm2孢子印于400 mL無菌純凈水，搖勻。取1 mL涂布于9 cm的PDA平板培養基，25℃培養5 d。孢子萌發后用1 μL槍頭的尖端部分，在孢子萌發處垂直打孔，移入新的平板。挑取數量80個～100個，插片25℃培養。菌絲長至插片0.4 mm～0.5 mm時，顯微鏡檢有無索狀聯合，無索狀聯合的為單孢菌絲，分別編號。P99簡稱P，編號P1～P100；NY-2簡稱Y，編號Y1～Y80。

1.3.2 單孢雜交

根據單孢菌絲生長速度、氣生菌絲濃密度將單孢菌絲分類。挑選菌絲濃密、長速快的平板2皿，菌絲稀疏、長速快的平板2皿，菌絲濃密、長速慢的平板1皿，菌絲稀疏、長速慢的平板1皿。每個親本挑選6個單孢菌絲為配子，每個配子培養基用4 mm打孔器打孔，挑取2個配子菌絲塊接種于同一培養皿，間距1 cm。25℃對峙培養5 d～7 d后，菌絲體融合，融合處形成拮抗線，于2個菌絲塊外側0.5 cm處挑取菌絲，轉接至新的培養基，每側轉接5皿～6皿。每2個配子雜交獲得2個雜交子，共獲得72個雜交子。

1.3.3 雜交子篩選

配子雜交之后的獲得的雜交子成為姊妹對，二者間根據菌絲長勢，淘汰菌絲長勢稀疏、生長速度較慢的雜交子。各姊妹對兩兩之間挑選菌絲長勢良好的進行對峙培養，挑選有拮抗反應雜交子進入出菇篩選試驗。

1.3.4 熟料袋栽篩選

初篩栽培時間為2015年9月5日。按栽培料的配方，采用熟料栽培方式，菌袋使用規格為14 cm×18 cm×0.005 cm的聚丙烯袋，2.5 cm套環封口，每袋裝干料200 g。每個雜交子接種10袋，24℃～25℃培養，菌絲滿袋后，去除套環，移入棚內進入出菇管理，棚內溫度10℃～30℃，濕度70%～90%，光照、二氧化碳濃度自然。測量第一茬菇現蕾時間、產量、子實體外觀特性，篩選黑色或藍黑色、柄短、圓整、貝殼形或者扇形、出菇早、產量高的為優勢菌株。

1.3.5 工廠化瓶栽篩選

以熟料袋栽篩選的優勢菌株為試驗菌株，采用工廠化栽培常用的1 100 mL塑料瓶，每瓶裝栽培料干料250 g，每個菌株接種4筐，每筐16瓶。24℃暗光培養，二氧化碳濃度≤0.08%，空氣濕度60%，菌絲滿瓶后，13℃～15℃低溫處理3 d～5 d。現蕾揭去瓶蓋，移入出菇室，保持室內溫度13℃～16℃，濕度80%～90%，二氧化碳濃度≤0.06%，光照強度150 lx～200 lx。子實體7成～8成熟時采收，比較菌株間出菇率（Rd，%），其計算公式為：

式中：S為總瓶數（瓶）；X為未出菇瓶數（瓶）。

觀察子實體性狀，測定產量，計算生物學效率，篩選出一茬菇生物學效率50%以上的優良菌株，作為下一輪參試品種。生物學效率（BE，%）的計算公式為：式中：Ffw為子實體鮮重（g）；Sdw為基質干重（g）。

1.3.6 優勢菌株品種比較

以1.3.5中篩選的優勢菌株為參試菌株，以生產中灰美2號 （CK1）、黑抗 650（CK2）、農平 4號（CK3）主栽品種及P99（親本）為對照菌株，采用瓶栽和袋栽2種方式，每個品種接種10筐，每筐16瓶。6成～7成熟時采收，隨機抽取3筐測定子實體產量、單朵重、子實體性狀。計算生物學效率、成菇比例，分析優勢菌株的生物學特性。

1.3.7 品質分析

1.3.6中篩選的優勢菌株，子實體6成～7成熟時采收，40℃烘干后，測定優勢菌株與對照菌株CK1、CK2、CK3、P99的粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、氨基酸含量。氨基酸采用GB 5009.124-2016食品中氨基酸的測定方法[9]，蛋白質采用GB 5009.5-2016食品中蛋白質的測定[10]，粗脂肪采用GB 5009.6-2016食品中脂肪的測定方法[11]。

1.3.8 多點栽培試驗

將1.3.6篩選得到的優良平菇菌株分別在新鄉、周口、鄭州等地采用當地玉米芯原料及配方進行熟料栽培，以當地主栽品種為對照，檢測該品種的適應性。

1.3.9 生物學特性分析

1）最適生長溫度篩選

以PDA為培養基，母種試管接種后，25℃培養4 d，再分別置于0℃、3℃、5℃、10℃、15℃、20℃、22℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃培養，每個處理6皿。觀察菌絲長勢，測量菌絲生長速度，篩選出菌絲致死溫度及最適宜生長溫度。

2）最適出菇溫度篩選

菌絲滿袋后，分別放置于區間溫度為10℃～15℃、16℃～20℃、21℃～25℃，每個溫度處理 30袋。觀察出菇早晚，計算產量生物學效率，產量最高的出菇溫度為最適出菇溫度。

1.3.10 數據分析

數據統計分析采用Excel 2010，數據的差異顯著性分析采用SPSS 19。

2 結果分析

2.1 單孢菌絲篩選

根據單孢菌絲長勢濃密度和快慢差異，分為：A1型（快、濃密）、B1型（快、稀疏）、A2型（慢、濃密）、B2型（較慢、濃密）。分別挑選A1型2個，B1型2個，A2型、B2型各1個，共6個單孢菌株作為雜交材料，見表1。

表1 單孢菌株編號Tab.1 Single spore strains number

2.2 雜交子篩選

單孢菌絲兩兩配對獲得36對、72個雜交子，根據雜交子菌絲形態差異篩選出菌絲生長快、長勢濃密的雜交子49個，49個雜交子兩兩之間做拮抗反應，共1 176組，雜交子之間均有拮抗反應，見圖1。

圖1 姊妹對雜交子之間的拮抗反應Fig.1 Antagonistic reaction between sisters to hybrids

由圖1所示，單孢菌株Y6分別與P3、P7、P9、P10、P14單孢菌株雜交，獲得Y6P3、Y6P7、Y6P9、Y6P14、Y6P10雜交子。Y6P3雜交子與 Y6P7、Y6P9、Y6P14、Y6P10姊妹對之間存在溝型拮抗線，表明Y6PX系列姊妹對之間為差異菌株。

2.3 初選優勢菌株

初篩菌株部分子實體性狀見圖2，其產量及性狀特征統計見表2。

圖2 部分菌株子實體性狀Fig.2 Fruit body characters of some strains

表2 參試菌株產量及子實體性狀Tab.2 The yield and fruit body characteristics of tested strains

由圖2及表2可知，按照1.3.4的栽培方法，49個雜交菌株產量、生物學性狀表現出豐富的差異性。顏色從灰白到淺灰、深灰、藍黑和黑色，菌柄有短、中長、長類型，菌蓋形狀有內卷、平展、貝殼狀等，菌蓋厚、薄不同。最早出菇時間為2015年10月19日，最晚出菇時間2015年11月26日，P7Y6菌株由于感蟲、感病未能出菇。設定初選指標為菇型圓整、柄短，菌蓋顏色深、厚薄適中，生物學效率50%以上，共篩選出15個優勢菌株：P14Y6、P14Y9、Y9P9、Y9P7、Y9P10、Y6P10、P3Y6、Y6P3、Y6P9、Y6P14、Y9P14、P10Y9、Y9P3、Y8P3、P10Y6。

2.4 工廠化栽培初選

15個優勢菌株一茬菇產量及子實體性狀統計見表3。

表3 15個優勢菌株產量及子實體特性Tab.3 The yield and fruit body characteristics of 15 superiority strains

由表3可知，參試菌株出菇整齊度、產量、子實體性狀、顏色等差異顯著。P14Y6菌株現蕾整齊，出菇整齊度為93.8%，較其他菌株高6.3%～62.5%；一茬菇每瓶平均產量達到178 g，生物學效率71.2%，較其他菌株高5.2%～38%；菌蓋幼時黑色，成熟藍黑，直徑3.0 cm～4.5 cm，厚1.0 cm～1.2 cm，韌性強；菌柄短，長1.0 cm～1.2 cm，直徑0.5 cm～1.0 cm；較其他品種更符合工廠化生產要求，因此該菌株確定為優勢菌株。

2.5 品種比較試驗

優勢菌株P14Y6與對照菌株的出菇情況及子實體性狀見表4、表5。

表5 參試菌株子實體性狀Tab.5 Fruit body characteristics of the tested strain

由表4可知，采用瓶栽P14Y6菌株的菌絲滿瓶天數為29 d，與3個對照菌株（CK1、CK2、CK3）差異不顯著，較親本菌株慢2 d；參試菌株出菇率的整齊度為93.8%，與親本菌株P99一致，較3個對照菌株高12.5%～25.0%；平均單瓶產量185 g，一茬菇平均生物學效率為74%，顯著高于3個對照品種及親本菌株10%～14%，最高達到88%；該菌株成菇率為64.5%，較親本及對照高24.5%～32.2%。6成～7成熟時，菌蓋藍黑色，直徑5 cm～6 cm，韌性強，菌柄長0.5 cm～0.7 cm，較其他品種短，菌蓋厚薄適中，較適合瓶栽工廠化生產。

2.6 品質分析結果

菌株P14Y6的營養分析結果見表6。

表6 參試菌株營養分析結果Tab.6 Results of nutrition of test strain analysis

由表6可知，優勢菌株P14Y6菌株含有17種氨基酸，每100克干菇總氨基酸含量17.12 g，蛋白質含量25 g，比親本略低，高于3個對照菌株1.3%～3.4%；粗脂肪含量1.6 g，與親本相當，高于CK2、CK3；粗纖維7.72 g低于CK3，高于其他菌株。

2.7 多點栽培試驗結果

在新鄉、鄭州、原陽3個試點進行瓶栽和袋栽2種模式栽培試驗；每個試驗點100袋，以黑抗650為對照，其參試結果見表7。

表7 不同地區參試菌株生物學效率Tab.7 Biological efficiency of tested strains in different regions

由表7可知，新鄉、鄭州試驗點該菌株袋栽第一茬菇生物學效率分別為63.6%，69.5%，較對照高8.3%～13.1%。原陽試驗點瓶栽生物學效率67.8%，較對照高13.2%。3個試驗點在生產過程中均未出現黃枯病。

該品種2017年通過河南省農作物品種鑒定，獲得證書，定名為黑平16-1。

2.8 菌絲及子實體生長特性結果分析

2.8.1 菌絲生長溫度分析

菌株黑平16-1在不同溫度下菌絲生長情況見表8。

表8 不同培養溫度菌絲生長速度Tab.8 Mycelial growth rates at different culture temperatures

由表8結果表明，該菌株在3℃以下菌絲不能生長，3℃～35℃均能正常生長。菌絲生長速度差異顯著，最適宜生長溫度25℃～28℃；菌絲生長致死溫度為40℃（24 h）；溫度升高至30℃以上，菌絲長勢稍稀疏。

2.8.2 出菇溫度分析

不同溫度對菌株黑平16-1出菇的影響見表9。

表9 溫度對出菇率、產量的影響Tab.9 Influence of temperature on the rate of fruiting and yield

由表9可知，10℃～15℃條件下，該菌株出菇率93.5%，分別較 16℃～20℃、21℃～26℃高 3.5%～6.0%。每瓶平菇產量185 g，生物學效率74%，產量分別較其他處理高60 g，生物學效率提高17.2%～20.8%；因此該品種最適宜出菇溫度為10℃～15℃。

3 結論與討論

平菇工廠化生產是未來食用菌生產發展的趨勢，對品種的要求與傳統栽培模式差異較大。韓國對工廠化瓶栽平菇的研究較多，據現有報道一茬菇的生物效率最高為84%[12]。目前國內工廠化平菇的栽培尚處于起步階段，專用品種的選育未見報道；單孢雜交仍然是食用菌品種選育的重要途徑，如何從大量的孢子中挑選優良的單孢菌絲是單孢雜交育種的關鍵，根據陳士瑜等[13]的經驗以不超過10個單孢為適宜。而香菇（Lentinus edodes）中同種交配型的孢子單核體遺傳相似性僅僅分別為66.3%，71.7%[14]；平菇與香菇均屬于典型的四極性異宗配合[15]；因此單孢之間的遺傳差異性較為豐富，挑選的單孢雜交菌株需要具備較高的代表性，否則很難通過雜交選育出優良菌株。

在篩選單孢的過程中，一些生長較慢的單孢往往被忽略，但是生長緩慢的菌株可能與帶有不親和的因子有關，在雜交過程生長緩慢的單孢菌絲并不影響雙核菌絲的生長。因此試驗以長勢和生長速度2個指標結合選取了6個不同類型的單孢子菌株，在雜交組合菌株的篩選過程中則淘汰了雙核菌絲生長較慢、長勢稀疏的菌株，減少了后續栽培篩選數量。如果這種單孢菌絲形態表型差異可作為篩選鑒定的途徑，則會大大提高育種效率，當然，后續還需要進一步研究菌絲形態差異與單核體遺傳配合力研究作為理論支撐。

以黑色高產平菇菌株P99與野生平菇菌株NY-2為親本，通過單孢雜交，多次栽培篩選，獲得了優勢菌株P14Y6。該菌株子實體疊生，短柄，藍黑色，菌蓋較厚，韌性強；菌絲生長溫度為3℃～35℃，最適宜出菇溫度11℃～15℃。與親本及3個生產菌株相比，該菌株工廠化瓶栽出菇整齊度為93.8%，高于對照菌株12.5%～25%；平均產量185 g/瓶，最高產量220 g/瓶，一茬菇平均生物學效率74%；高于3個對照品種及親本菌株10%～14%；在多點試驗中瓶栽和袋栽均高于對照菌株。2017年通過了河南省農作物品種鑒定，命名為黑平16-1。