PM 2.5混懸液對3種癌細胞侵襲和遷移能力的影響

李柏茹，秦雙建，#，蔡 穎，李閏冰，關 嵐，肖 芳，曾 明，徐新云

(1．中南大學湘雅公共衛生學院，湖南 長沙410078；2．南華大學公共衛生學院，湖南衡陽 421001；3．深圳市疾病預防控制中心，廣東 深圳 518055)

大氣細顆粒物(particulate matter 2.5，PM2.5)污染是國內外一直關注的公共衛生問題。《2015年全球疾病負擔(global burden of disease，GBD)研究》將PM2.5列為第五大死亡因素，并且PM2.5導致了全球420萬人死亡和1.031億殘疾調整生命年(disability adjusted life year，DALYs)損失[1]。據估計，2017年中國有124萬人的死亡可歸因于空氣污染，其中85.166萬人的死亡來自環境PM[2]。PM2.5可通過氧化應激、炎癥反應、免疫紊亂、DNA損傷和遺傳毒性、信號通路改變等機制對機體造成損傷[3]。長期的PM2.5暴露會使肺癌患者的死亡率明顯增加，并且確診后的肺癌患者生存期也會縮短，說明PM2.5在肺癌進展方面具有一定的促進作用[4]。作為人體主要代謝器官的肝臟也是PM2.5的作用器官之一，調查研究發現確診的肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者暴露于PM2.5可能會縮短其生存期，并且隨著暴露濃度的升高產生更加嚴重的影響[5]。同時國外一項流行病學調查發現室外空氣污染與腎癌的發生密切相關[6]。將A549細胞暴露于25和50μg/mL的北京市可吸入顆粒物PM10水溶性成分持續48 h，可顯著抑制miR-26a并上調lin-28同源物B(lin-28 homolog B，LIN28B)，進而激活A549細胞中的白介素6(interleukin 6，IL-6)以及信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)，從而促進上皮-間質并加速細胞侵襲遷移能力[7]。岳慧峰等[8]收集太原市郊區住宅區PM2.5和PM10，隨后實驗發現PM2.5和PM10可以通過活性氧(reactive oxygen species，ROS)介導的上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)活化和細胞外基質降解途徑誘導A549細胞遷移和侵襲增強。PM2.5可通過促進血管內皮細胞介導的腫瘤血管新生、激活腫瘤細胞生成擬態直接形成腫瘤血管、使腫瘤干細胞向腫瘤內皮細胞轉化、誘發局部慢性炎癥反應從而發生EMT、破壞血管穩態、增加血管通透性等途徑促進癌細胞侵襲和遷移[9]。

目前有很多關于PM2.5增強癌細胞侵襲和遷移能力的假說，但鮮有見到低濃度PM2.5急性染毒也可以促進肺、肝和腎癌細胞遷移及侵襲的實驗研究，因此本研究旨在探究低濃度PM2.5是否可以促進癌細胞侵襲和遷移。課題組前期已經發現，PM2.5可以刺激人支氣管上皮細胞(human bronchial epithelial cells，HBE)、人正常肝細胞(human liver cell L02，L02)和人腎上皮細胞(human kidney 2 cells，HK-2)中部分原癌基因表達升高，表明PM2.5染毒對正常細胞中癌基因的表達具有促進作用[10-11]，但PM2.5對相應的癌細胞是否具有促進作用即對其侵襲遷移的影響亟待發現。因此本文以人肺癌A549細胞、人肝癌HepG2細胞和人腎癌A498細胞3種癌細胞為研究對象，檢測PM2.5對3種細胞遷移、侵襲能力的影響，為探討PM2.5對癌細胞侵襲和遷移能力的影響提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

A549細胞、HepG2細胞和A498細胞購于中國科學院上海細胞庫；Transwell小室購于美國Corning公司；Matrigel基質膠購于美國Corning公司；結晶紫購于上海碧云天公司；多聚甲醛購于國藥集團生物有限公司；DMEM培養液、MEM培養液、胎牛血清及0.25%Trpsin-EDTA購于美國Gibco公司；生物顯微鏡Leica DM3000購于德國Leica公司；TH150F中流量采樣器購于武漢天虹公司。

1.2 PM2.5樣品采集與制備

用武漢天虹TH150F中流量采樣器和80 mm直徑的石英濾膜，按100 L/min的流量連續采樣24 h，連續采樣3 d，采樣地點設置在太原山西大學校園，采樣時間為秋冬季。采集前后對濾膜稱重，采集后將濾膜剪成2 cm×2 cm放于燒杯中，加入超純水完全浸沒濾膜，杯口用錫箔紙密封，超聲震蕩30 min后取出濾膜，將PM2.5樣品懸液轉移到干凈的真空冷凍物料盤中，再次密封物料盤口后，于-80℃冰箱冷凍24 h；取出后，用封口膜替換錫箔紙密封物料盤，扎孔，于真空冷凍干燥機中至PM2.5完全干燥；將物料盤放在超凈工作臺中紫外燈滅菌2 h，用高壓滅菌的超純水溶解干燥的PM2.5顆粒，混合均勻完成PM2.5混懸液的制備，分裝標記后于-20℃保存待用，每次使用前振蕩混勻。

1.3 細胞培養與染毒

使用完全培養基(含10%胎牛血清的DMEM或MEM)于37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養A549、HepG2和A498細胞，傳代時將細胞傳至6孔板，待細胞狀態穩定且匯合度達80%時進行染毒。本課題組前期開展大量實驗探索短時間低劑量的PM2.5染毒正常細胞后產生的危害作用，已經利用10和50 μg/mL的PM2.5染毒人支氣管上皮細胞、人正常干細胞和人腎上皮細胞24 h，并發現這兩個濃度的PM2.5染毒24 h可以導致正常細胞癌基因表達發生明顯的變化[11-13]，所以本實驗擬在此基礎上初步探索相同終濃度的PM2.5染毒24 h對3種癌細胞遷移和侵襲能力的影響。故本實驗將終濃度為10和50μg/mL的PM2.5設定為低劑量染毒組和高劑量染毒組，將不含血清的DMEM或MEM培養基作為陰性對照組，染毒3種癌細胞24 h。

1.4 Transwell小室侵襲和遷移實驗

在24孔細胞培養板中加入含10%FBS的DMEM或MEM培養基，取出4℃冰箱中解凍的Matrigel(基質膠)按1∶8的比例用不含FBS的培養基稀釋，取100 μL鋪滿Transwell小室底部(Transwell孔徑為8μm)，并在37℃培養箱中孵育過夜，形成基質屏障膜。將染毒24 h后的細胞消化下來并用無血清培養基制成濃度為1×105個/mL濃度的細胞懸液，每小室滴加200 μL，于37℃培養箱中培養24 h，結束后取出Transwell小室，并用PBS洗滌2次后，用多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色35 min，把沒有穿過膜的細胞用棉簽小心擦除，在正置顯微鏡下隨機選取5個視野，計數穿膜細胞的數目并取均值。遷移實驗也采用Transwell小室法，除不包被Matrigel基質膠外，其余步驟與侵襲實驗相同。

1.5 統計分析

實驗均獨立重復3次，采用GraphPad Prism 6.0分析作圖，計量資料以±s表示，兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PM2.5染毒增強A549細胞的遷移、侵襲能力

Transwell小室法遷移實驗結果如圖1所示，陰性對照組、10和50μg/mL PM2.5染毒組中穿膜細胞數分別為(356.33±30.92)、(476.33±28.50)和(563.33±74.00)個。侵襲實驗結果如圖2所示，陰性對照組、10和50μg/mL PM2.5染毒組中穿膜細胞數分別為(188.33±9.45)、(313.00±7.94)和(404.00±57.66)個。上述結果表明10和50μg/mL的PM2.5可使A549細胞的遷移、侵襲能力增強(P＜0.05或0.01)。

圖1 Transwell法檢測PM2.5對A549細胞遷移能力的影響

圖2 Transwell法檢測PM 2.5對A549細胞侵襲能力的影響

2.2 PM2.5染毒增強HepG2細胞的遷移、侵襲能力

Transwell小室法遷移實驗結果如圖3所示，陰性對照組、10和50μg/mL PM2.5染毒組中穿膜細胞數分別為(86.42±4.75)、(140.00±16.15)和(234.17±9.06)個。侵襲實驗結果如圖4所示，陰性對照組、10和50 μg/mL PM2.5組中穿膜細胞數分別為(48.33±3.26)、(97.75±6.63)和(123.92±8.57)個。上述結果表明：與陰性對照組比較，10和50μg/mL的PM2.5可使HepG2細胞的遷移、侵襲能力增強，差異均具有統計學意義(P＜0.05或0.01)。

圖3 Transwell法檢測PM2.5對Hep G2細胞遷移能力的影響

圖4 Transwell法檢測PM 2.5對Hep G2細胞侵襲能力的影響

2.3 PM2.5染毒增強A498細胞的遷移、侵襲能力

Transwell小室法遷移實驗結果如圖5所示，陰性對照組、10和50μg/mL PM2.5組中穿膜細胞數分別為(42.33±6.43)、(80.00±6.08)和(174.67±25.01)個。侵襲實驗結果如圖6所示，陰性對照組、10和50μg/mL PM2.5組中穿膜細胞數分別為(5.67±5.03)、(21.33±5.13)和(40.67±6.81)個。上述結果表明：與陰性對照組比較，10和50μg/mL的PM2.5可使A498細胞的遷移、侵襲能力增強，差異均具有統計學意義(P＜0.05或0.01)。

圖5 Transwell法檢測PM2.5對A498細胞遷移能力的影響

3 討論

腫瘤細胞的轉移是癌癥復發以及治療失敗的重要原因，且腫瘤細胞的轉移過程非常復雜，涉及多條信號通路、轉錄因子及酶的活化。但是過去關于PM2.5與癌癥的研究多集中在PM2.5致正常細胞和癌細胞損傷等作用方面[14-15]，卻未見關于PM2.5對癌癥早期轉移的研究報道。因此本研究就PM2.5對肺癌細胞、肝癌細胞和腎癌細胞的侵襲和遷移能力進行了檢測，結果發現PM2.5可以明顯增強3種癌細胞的侵襲和遷移能力。

肺癌是目前人類所有癌癥中發病率最高的癌癥，在2018年全球新增癌癥中肺癌占11.6%[16]，同時肺癌也是死亡率最高的癌癥，在2018年全球全部死亡病例中肺癌占18.4%[17]。隨著工業化的發展，環境與健康的關系逐漸得到了人們的重視，有流行病學調查顯示PM2.5與包括肺癌在內的多種呼吸系統疾病的進展有著密切關聯[18]。本研究得到10和50μg/mL PM2.5可以增強A549細胞的侵襲和遷移能力，提示PM2.5可能在肺癌的轉移過程中發揮著一定的作用。有學者在研究中發現，PM2.5可通過提高Wnt/β-catenin通路活性及其下游cyclin D1、snail、slug、MMP-2和MMP-9的蛋白表達或者是轉移相關蛋白-細胞鈣黏蛋白-N的表達量，降低鈣黏蛋白-E的表達量從而增強A549細胞的遷移、侵襲能力，進一步導致肺癌轉移發生率增加[19-20]。肝癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，病死率排在所有腫瘤中第2位，不但惡性程度高，而且進展迅速、病死率高[21]。隨著醫療條件的改善進步，肝癌患者生存率雖大幅度提高，但高轉移率和高復發率依舊是肝癌治療的最大障礙[22]。目前很少有關于PM2.5與肝癌轉移的相關機制研究報道，但是有學者已經發現PM2.5可以縮短肝細胞癌患者的生存期[5]，說明PM2.5可能在肝癌的進展中發揮著一定的作用。本研究發現PM2.5可以增強HepG2細胞的侵襲和遷移能力，這與上述的PM2.5縮短肝細胞癌患者生存期相一致，說明PM2.5可能也在肝癌的轉移過程中起著一定的促進作用，國內學者也發現PM2.5可以激活RACα-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶導致人基質金屬蛋白酶-13的過度表達，刺激HCC細胞的遷移和侵襲[23]。腎癌是起源于腎小管上皮細胞的惡性腫瘤，盡管在所有腫瘤中腎癌的發病率偏低，但是近年來中國腎癌的發病率和死亡率均呈現上升趨勢[24]。目前腎癌常用的療法包括手術、放化療和中醫輔助治療等，但同大多數腫瘤類似，腎癌細胞也易于發生遠處轉移，對于這些晚期腎癌患者，臨床上仍然缺乏有效的治療方式導致遠期預后仍較差[25-26]。雖然已有流行病學研究發現PM2.5與腎癌的發生有關，但仍未有PM2.5增強腎癌轉移的研究報道。本研究發現PM2.5可以使得A498細胞的遷移和侵襲能力增強，與肺癌和肝癌的相關研究結果類似。腎癌轉移主要是通過腫瘤分泌促進血管內皮生長因子以大量生成腫瘤內血管[27]，配合淋巴管進行全身性播散，與此同時腫瘤細胞在進展過程中發生EMT，腫瘤細胞失去細胞極性，細胞之間的連接變少，增加細胞遷移和侵襲的能力[28]。鄒寒冰等[29]發現當抑制RAP1-JNK信號途徑時，會促進ACHN細胞發生間質-上皮轉化，可以有效抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲，為后續進行PM2.5促進腎癌細胞侵襲遷移能力的機制研究提供了新思路。

本研究初步發現太原市PM2.5可以促進肺癌細胞、肝癌細胞和腎癌細胞的侵襲和遷移，具有一定創新性，但仍存在一些不足，如未對侵襲遷移相關的特異性生化指標、蛋白指標進行測定以證實PM2.5對癌細胞侵襲遷移的促進作用。實驗中所用細胞均為傳代次數不超過10代、生長狀態良好且無微生物污染細胞，進行侵襲遷移實驗時3種細胞均按照完全相同的處理方法進行，染毒所用PM2.5樣品均為同一批次制作完成，以減少細胞狀態和PM2.5樣品批次對侵襲遷移結果的影響。本研究結果表明，PM2.5可促進人肺癌細胞A549、人肝癌細胞HepG2和人腎癌細胞A498的侵襲和遷移，PM2.550μg/mL劑量組比10μg/mL劑量組的促進作用更明顯，提示PM2.5對癌細胞侵襲和遷移有促進作用，為今后進一步深入開展PM2.5的致癌機制和對癌細胞侵襲、遷移的調控機制提供了科學依據。