刺山柑果風濕止痛凝膠膏對SD大鼠的一般生殖毒性

許文黎，何 江，李曙芳，王新鋼，張亞娟，劉 歡，岳 娟，李建國，楊偉俊，*

(1．中國輻射防護研究院藥物安全性評價中心，山西 太原 030006；2．新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004)

刺山柑果是山柑科刺山柑(Capparis spinose L.)的果實[1]，具有較好的抗炎、鎮痛、緩解關節炎等作用[2-3]，是維吾爾醫學常用的傳統藥材。通過對刺山柑果抗炎鎮痛活性部位進行篩選，研制經皮給藥新劑型——刺山柑果風濕止痛凝膠膏，其藥效學實驗研究結果表明，其對抗炎、鎮痛和抗關節炎有良好的治療作用[4-5]，但是對于其生殖毒理方面的研究鮮見報道。本文對刺山柑果風濕止痛凝膠膏含藥貼進行了一般生殖毒性研究，旨在探討其對大鼠的一般生殖毒性，為其臨床用藥提供安全性評價依據。

1 材料與方法

1.1 受試品與試劑

刺山柑果風濕止痛凝膠膏(批號20171015)，每帖相當于含生藥材20 g；對照品為輔料貼(批號2017 1101)，不含藥材。受試品與對照品均由新疆維吾爾自治區藥物研究所提供。注射用環磷酰胺(江蘇盛迪醫藥有限公司生產，每瓶0.2 g)，氯化鈉注射液(石家莊鵬海制藥有限公司生產)。

1.2 主要儀器

生物顯微鏡CX23和CX21均為奧林巴斯(中國)投資有限公司產品；電熱恒溫培養箱303-00A購自北京心雨儀器儀表有限公司；游標卡尺0～150 mm購自哈爾濱量具刀具集團有限責任公司。

1.3 實驗動物

SD大鼠，SPF級，250只，雌、雄各半，8～9周齡，均為未育未孕動物，開始給藥時雌鼠體質量(255.1±17.3)g，雄鼠體質量(343.5±12.7)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK-(京)2016-0006，動物質量合格證號114007 00268549。飼養于中國輻射防護研究院藥物安全性評價中心屏障環境內，許可證號SYXK(晉)2013-0002。

1.4 分組和給藥

SD大鼠按體質量隨機分為刺山柑果風濕止痛凝膠膏高(117.8 g/m2)、中(58.9 g/m2)、低(29.5 g/m2)3個劑量組、輔料對照組(輔料貼)和陽性對照組(環磷酰胺)，共5組，每組雌雄各25只。

每天給藥1次，雄鼠給藥首日定義為D1，雄鼠連續給藥4周、雌鼠連續給藥2周后，同組中的雌鼠與雄鼠按照1∶1合籠交配，交配期間持續給藥；交配期間每日上午對雌鼠進行陰道涂片檢查，經鏡檢發現精子即為交配成功，交配成功當日定義為妊娠第0天(GD0)；交配成功的雌鼠繼續給藥至妊娠第6天(GD6)。陽性對照組雄鼠在D1、雌鼠在D15進行腹腔注射，單次給藥，劑量為0.1 g/kg。

1.5 觀察指標[6-7]

記錄給藥期間大鼠一般狀態、合籠和交配情況；交配前雄鼠和雌鼠每周稱體質量2次、記錄攝食量1次，孕鼠于GD0、GD3、GD6、GD10、GD14稱體質量，于GD0、GD6、GD12稱量攝食量；雄鼠確定交配成功后麻醉放血處死，摘取睪丸、附睪組織，分別稱取質量，計算臟器系數，測量睪丸橫徑，進行精子計數、精子活力和形態分析；雌鼠于GD14麻醉放血處死，計錄黃體數、著床數、活胎數、死胎數和吸收胎數，稱取卵巢和子宮質量及胎質量(連子宮)，計算宮外增加質量和臟器系數。

1.6 統計學方法

運用SAS 9.4統計軟件，實驗數據用±s表示，計量資料進行方差分析；交配率、受孕率、活胎率等資料采用χ2檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 大鼠一般狀態觀察

給藥期間，各組大鼠行為活動正常，未給藥區域的被毛濃密有光澤，外觀體征、進食及糞便等均未見明顯異常，無動物死亡。

2.2 刺山柑果風濕止痛凝膠膏對大鼠各時期體質量的影響

與輔料對照組相比，刺山柑果風濕止痛凝膠膏對各劑量組大鼠的體質量無明顯影響(P＞0.05)，對孕鼠體質量和妊娠期宮外增加質量亦無明顯影響(P＞0.05)，見表1。

表1 刺山柑果風濕止痛凝膠膏對妊娠期孕鼠體質量的影響(g)

2.3 刺山柑果風濕止痛凝膠膏對大鼠攝食量的影響

刺山柑果風濕止痛凝膠膏各劑量組雄鼠和雌鼠的攝食情況與輔料對照組比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)，陽性對照組雄鼠在D3的攝食量明顯低于輔料對照組(P＜0.01)，孕鼠GD0的攝食量低于輔料對照組(P＜0.05)，結果見表2和表3。

表2 刺山柑果風濕止痛凝膠膏對雄鼠攝食量的影響(g/d，n=25)

表3 刺山柑果風濕止痛凝膠膏對雌鼠和孕鼠攝食量的影響(g/d)

2.4 刺山柑果風濕止痛凝膠膏對大鼠生殖能力的影響

刺山柑果風濕止痛凝膠膏各劑量組大鼠的交配率、妊娠率、交配成功時間與輔料對照組間的差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表4。

表4 刺山柑果風濕止痛凝膠膏對雄鼠和雌鼠生殖能力的影響(n=25)

2.5 刺山柑果風濕止痛凝膠膏對雄鼠生殖器官的影響

與輔料對照組相比，刺山柑果風濕止痛凝膠膏各劑量組對雄鼠的附睪和睪丸臟器質量、睪丸橫徑和附睪精子數量、精子活動度無明顯影響(P＞0.05)，58.9和29.5 g/m2劑量組的附睪精子畸形率降低(P＜0.01)，3個劑量組的睪丸系數均明顯降低(P＜0.01)；陽性對照組的左側睪丸橫徑、附睪精子數量、附睪精子活動度、附睪系數和睪丸系數明顯降低(P＜0.01)，附睪精子畸形率明顯升高(P＜0.01)，見表5。

表5 刺山柑果風濕止痛凝膠膏對雄鼠生殖器官的影響(n=25)

2.6 刺山柑果風濕止痛凝膠膏對孕鼠妊娠結局的影響

與輔料對照組相比，刺山柑果風濕止痛凝膠膏對孕鼠的子宮連胎質量、平均黃體數、平均著床數、平均活胎數、平均死胎數、子宮和卵巢質量及其臟器系數均無明顯影響(P＞0.05)；117.8 g/m2劑量組的著床前丟失率、吸收胎率升高(P＜0.05)，著床率和活胎率降低(P＜0.05)；29.5 g/m2劑量組的著床前丟失率明顯降低(P＜0.01)，著床率明顯升高(P＜0.01)；陽性對照組子宮連胎質量、平均活胎數、活胎率明顯降低(P＜0.01)，平均死胎數、死胎率、平均吸收胎數、吸收胎率明顯升高(P＜0.01)，見表6。

表6 刺山柑果風濕止痛凝膠膏對雌鼠妊娠結局的影響(n=25)

3 討論

生殖毒性試驗是藥物非臨床安全性評價的重要組成部分，一般生殖毒性試驗主要通過觀察藥物對動物生殖功能和胚胎發育過程的影響，判斷其可能對動物的精卵形成、交配、著床、胎仔的吸收和死亡以及宮內活胎發育等的毒性作用。

在本研究中，與輔料對照組相比，環磷酰胺陽性對照組雄鼠D4體質量明顯降低；雄鼠在D3的攝食量明顯降低；孕鼠GD0的攝食量有所降低；雄鼠的左側睪丸橫徑、附睪精子數量、附睪精子活動度、附睪系數和睪丸系數明顯降低，附睪精子畸形率明顯升高；孕鼠的子宮連胎質量、平均活胎數、活胎率明顯降低，平均死胎數、死胎率、平均吸收胎數、吸收胎率明顯升高，結果與文獻[8]報道的環磷酰胺對SD大鼠的作用結果較為一致，表明陽性模型建立成功，該實驗系統可靠。

刺山柑果風濕止痛凝膠膏組雄性、雌性大鼠和孕鼠的一般狀況、體質量、攝食量與輔料對照組相比均無明顯變化，表明刺山柑果風濕止痛凝膠膏對親代大鼠無毒性作用。

刺山柑果風濕止痛凝膠膏各劑量組的睪丸系數較輔料對照組均降低(P＜0.01)；而各劑量組附睪系數、睪丸質量與輔料對照組相比降低，但無量-效關系。結合各組體質量和附睪、睪丸質量，雖然刺山柑果風濕止痛凝膠膏各劑量組解剖時體質量和附睪、睪丸質量與輔料對照組相比差異無統計學意義，但在數值上輔料對照組在解剖時體質量較小，附睪、睪丸質量較大，故導致其附睪、睪丸系數偏大，另外結合各劑量組雄鼠的交配行為、附睪精子數量、活動度、畸形率等數值均未發生明顯異常，考慮刺山柑果風濕止痛凝膠膏各劑量組的附睪、睪丸系數降低可能與個體體質量變化有關，表明刺山柑果風濕止痛凝膠膏對雄鼠生殖能力無明顯影響。

與輔料對照組相比，刺山柑果風濕止痛凝膠膏高劑量組著床前丟失率升高、著床率降低，低劑量組著床前丟失率降低、著床率升高，具有一定的量-效關系；高劑量組活胎率降低、吸收胎率升高，中、低劑量組無明顯變化，無量-效關系；各劑量組的平均活胎數、平均死胎數、平均吸收胎數、死胎率等均無明顯變化，實驗結果表明刺山柑果117.8 g/m2可能造成妊娠雌鼠的著床率和活胎率降低、吸收胎率升高，對雌鼠的生育力可能存在影響。

綜上，在本實驗劑量范圍內，刺山柑果風濕止痛凝膠膏對雄鼠的生育力無明顯毒性影響，高劑量(117.8 g/m2)刺山柑果風濕止痛凝膠膏對雌鼠的生育力存在一定影響，中(58.9 g/m2)、低(29.5 g/m2)劑量對雌鼠的生育力無明顯毒性。