酶聯免疫吸附檢測法臨床應用進展

酶聯免疫吸附檢測法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)于1971年建立，因其具有簡單、高效、靈敏、特異、穩定、試劑成本低等特點，被廣泛應用于臨床醫學診斷和研究、食品安全檢測、環境監測及生態學、植物資源等生命科學領域

。在醫學研究及臨床診斷方面，ELISA技術主要用于多種病原微生物所引起的感染性疾病的免疫診斷；同時，因其檢測的高效性，也常用于血清流行病學調查。其主要技術類型包括雙抗原(抗體)夾心法、間接法、競爭法、捕獲法、生物素-親和素等。

村民謝傳寶家里，香菇菌棒碼成垛，每個菌棒都長滿白色菌絲。“再過一個月，這些菌棒就能進棚出菇了。”謝傳寶說，他與老伴有三個收入來源：一是種香菇，每年能收獲4000袋；二是販香菇，農閑時到外地收購，送回村里轉賣；三是老伴有空就到加工廠打短工。夫婦二人四季不閑，一年收入10萬元以上。

1 ELISA常規臨床診斷應用

ELISA在臨床常規的測定項目主要包括以下4類。

1.1 抗原及其抗體檢測 ELISA在感染性疾病檢測中具有突出的優勢，在病毒檢測方面應用較廣，如肝炎病毒、艾滋病毒、巨細胞病毒、皰疹病毒、風疹病毒、流感病毒、麻疹病毒、SARS冠狀病毒、柯薩奇病毒、輪狀病毒、登革病毒、人乳頭瘤病毒、新型冠狀病毒等；在細菌檢測方面包括結核分支桿菌、幽門螺桿菌、布氏桿菌、軍團菌等；在其他類型病原體檢測方面包括梅毒螺旋體、弓形蟲、沙眼衣原體、肺炎支原體等。ELISA在免疫性疾病方面，可進行自身免疫病抗體的測定以及對過敏的診斷，如檢測風濕系列抗體、紅斑性狼瘡抗體、各種過敏原的抗體、甲狀腺球蛋白抗體、抗胰島素抗體、抗精子抗體、抗卵巢抗體、抗腎小球基底膜抗體等。

1.2 特種蛋白的檢測 各種免疫球蛋白、循環免疫復合物、細胞因子如白細胞介素家族(IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-11、IL-13等)及腫瘤壞死因子(TNF-α、TNF-β)、轉化生長因子-β(TGF-β)等。腫瘤標志物，如常規體檢腫瘤二項(甲胎蛋白、癌胚抗原)；消化道相關腫瘤標志物如CA199、CA242、CA724等；肺癌相關標志物如神經元特異烯醇化酶(NSE)、細胞角蛋白19片斷(CYFRA211)等；男性腫瘤標志物如前列腺特異性抗原(PSA)；女性腫瘤如卵巢癌標志物CA125、乳腺癌標志物CA153等。

2.6 內分泌及代謝性疾病 孫立山等

建立定量酶聯免疫吸附法檢測血清中胰高血糖素樣肽1(GLP-1)，通過識別各種形式GLP-1單克隆抗體，能夠一次檢測糖耐量受損(IGT)及2型糖尿病(T2DM)患者體內4種形式的GLP-1，無論是否具有活性，檢測結果都能較客觀地反映體內GLP-1的分泌狀況。該檢測方法的穩定性和精密度較好，對指導臨床個體化治療具有重要意義。

2.2 呼吸系統疾病 研究發現IL-18 和IL-33(ELISA檢測)兩種炎癥因子可能參與了呼吸道合胞病毒(RSV)致毛細支氣管炎和反復喘息的發病機制，且其水平與呼出氣一氧化氮(FeNO)水平有相關性

。有學者

證實在輔助診斷肺炎支原體感染方面酶聯免疫吸附檢測法優于冷凝集試驗。李榮娟

應用酶聯免疫吸附法檢測血清脂阿拉伯甘露糖抗體(LAM-IgG)水平，證實對早期肺結核的鑒別診斷具有一定的臨床價值。研究發現

血清TNF-α、IL-8和嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(ECP)水平(采用ELISA法檢測)升高與支氣管哮喘(Bronchial asthma，BA)發生及發展密切相關，進一步了解其網絡作用機制將對免疫治療及開發新的治療靶點和方法提供新思路。

2 ELISA臨床應用新進展

近年來通過研究者不斷摸索和實踐，ELISA的應用在很多方面取得新的進展。

2.10 腫瘤 有研究采用酶聯免疫吸附法分別檢測肺腺癌患者和健康體檢者血漿中p62的表達情況，提示p62 高表達與肺腺癌患者不良預后有關

。吳火友等

研究乙酰肝素酶(HPSE)及血管內皮生長因子(VEGF)在結直腸癌患者血清中的表達情況(均采用ELISA檢測)，認為聯合檢測HPSE和VEGF能夠提高結直腸癌診斷水平，可成為結直腸癌患者篩查、判斷預后及指導治療的指標。

1.4 血液中藥物濃度的檢測 如抗癲癇藥物、抗哮喘藥物、治療心臟病類藥物、抗生素等。這些以ELISA為依托建立的檢測方法為維護人們的健康與安全提供了便捷有效的途徑

。

通過以上分析，可知接收機鏈路的絕對時延和時延波動由通道中帶寬最窄濾波器決定的，因此在實際設計中要減小電路的絕對時延與時延波動，應滿足以下設計原則和措施：

2.4 循環系統疾病 高麗

應用酶聯免疫吸附法檢測ST段抬高性急性心肌梗死患者血漿和肽素濃度，認為該指標檢測價值高，能夠為臨床診斷及預后判斷提供有效依據。

2.3 消化系統疾病 研究發現補充牛乳鐵蛋白，可抑制腸道組織IL-1β和IL-6炎性因子的表達，對腸道組織有一定的保護作用

，而這兩個指標均利用酶聯免疫吸附法檢測。

2.5 泌尿系統疾病 運用酶聯免疫吸附法檢測特發性膜性腎病患者血清抗M型磷脂酶A2受體(PLA2R)抗體，可作為評價臨床療效的敏感性血清學指標

。周冉等

發現血清及尿中性粒細胞膠原酶相關脂質運載蛋白(NGAL)和胱抑素C在新生兒缺血缺氧性腎損傷的診斷中有重要意義，其指標的升高與腎臟損害程度密切相關。

治療組在治療之前JOA評分,P>0.05,差異不具備統計學意義;在治療之后,治療組的JOA評分要好于對照組,P<0.05,說明差異具備統計學意義。

1.3 非肽類激素的檢測 如雌二醇、皮質醇等。

2.7 肌肉、骨骼及結締組織疾病 代鳳雷等

采用酶聯免疫吸附法檢測早期膝骨關節炎大鼠滑膜組織中的S100A12、IL-1β、Galectin-3水平，證實這三種炎性細胞因子均與早期膝骨關節炎密切相關，為臨床早期診斷膝骨關節炎提供理論依據，同時明確Galectin-3在該病病情進展中持續表達。

2.9 婦產科疾病 有學者

探討產婦血清抗心磷脂抗體(ACA)和抗β2- 糖蛋白1(β2-GPl)抗體(ELISA檢測)與不良妊娠結局的關系，證實血清ACA各亞型及抗β2-GPl各亞型抗體檢測可用于評估不良妊娠結局。研究發現脂蛋白相關磷脂酶A2(LP-PLA2)水平的升高可能與妊娠期高血壓疾病的發生有關，母血中LP-PLA2水平的變化(用ELISA檢測)有可能作為疾病的監測指標

。

2.8 神經系統及精神疾病 研究表明，重癥顱腦損傷病人體內存在顯著的炎性反應與凝血機制紊亂，二者各指標間存在一定相關性，與病情嚴重程度密切相關

。黃成兵等

采用酶聯免疫吸附法檢測無抽搐電休克治療前后首發性精神分裂癥患者血清腦源性神經營養因子(BDNF)水平，證實BDNF可作為臨床療效指標。

Boosting算法也是一種基于數據集重抽樣算法，與Bagging算法主要區別在于需要動態調整訓練樣本中各數據權重，每一次迭代增加不能正確學習樣本權重，降低能正確學習樣本權重，從而提升在整個訓練樣本數據集上的學習正確率。基本算法如下。

2.1 感染性疾病 有學者

建立并驗證間接酶聯免疫吸附檢測法用于定量檢測大鼠血清中抗埃博拉病毒雙特異性抗體(MBS77E)濃度，并進行大鼠體內藥代動力學研究，為MBS77E的臨床研究提供了支持。該學者進一步

建立食蟹猴血清中抗西尼羅河病毒單抗MIL94的間接ELISA定量測定法，同時進行食蟹猴體內藥動學初步研究。

采用SPSS18.0統計軟件系統分析相關數據;兩組患兒治療2個月一般診療數據變化情況其中計量資料用(±s)表示,并用t檢驗;兩組患兒并發癥發生情況其計數資料用(n,%)表示,并用X2檢驗;P<0.05表示有統計學意義。

2.11 其他疾病 研究發現

，臍血Eotaxin高表達水平(運用ELISA檢測)是影響嬰兒濕疹患病的獨立危險因素，臍血Eotaxin水平對嬰兒濕疹的發生有一定的預測作用。

她是一位“被蒙住了雙眼的女子。在樹上，手持一支長長的樹枝，各種各樣代表不同身份職業的東西從上面落下——諸如權杖、書籍、冠冕、珠寶、武器等”（圖 4，Fortuna A）；另一個方案中，她是“坐在一個球體上的，被賦予了一對翅膀的女子”（Fortuna B）；還可以是“頭頂天球（Globo Celeste）手持豐饒角（Cornucopia）的女子”（Fortuna C）。

3 ELISA存在的不足與對策

3.1 在感染性疾病方面 基層血站主要是依靠酶聯免疫吸附檢測法對血液進行篩查，可在一定程度上檢出HBsAg、HCV、HIV，但仍存在部分弱陽性及灰區標本，具有局限性

。對策：針對酶免檢測陰性標本、弱陽性及灰區標本進行核酸檢測，可檢出假陰性標本，減少不確定性。在基層血站對無償獻血者的血液標本進行篩查時，采用酶免檢測與核酸檢測平行篩查可提高血液篩查準確性，減少血液傳播疾病風險，有利于保障臨床輸血安全性。在用酶聯免疫吸附檢測法及膠體金免疫層析法檢測血清2019-nCoVIgM時，發現中高水平IgM型類風濕因子易造成假陽性結果，針對陽性樣本進行尿素解離有利于降低假陽性的發生概率

。筆者認為針對實驗室日常采用酶聯免疫吸附法檢測各類肝炎病毒、艾滋病、梅毒等出現的陽性結果，要進行復查，需采用另外一種方法(免疫化學發光法或膠體金免疫層析法)或另外一個廠家的ELISA試劑盒進一步驗證，結果一致后方可發送檢驗報告。

3.2 試劑盒及操作方面 目前，我國自行研制的酶聯免疫吸附檢測法試劑盒存在一些問題，如研發的種類少、有的廠家試劑靈敏度低、不穩定、重現性低。另外，在ELISA臨床應用過程中，對于一些檢測的生物學樣本，可能存在個別干擾實驗的因素，如筆者在健康體檢人群中，曾發現個別溶血標本導致乙肝表面抗原呈現假陽性結果；此外，實驗過程中影響因素較多，如試劑加入量、檢測時間、檢測溫度等沒有嚴格按試劑說明書執行，檢測結果可能會出現假陰性情況，還可能會出現弱陽性及灰區。對策：試劑廠家增強自身研發能力和水平，增加檢測試劑盒種類、數量，提高檢測所需抗體和包被抗原的特異性，最大限度避免假陰性結果的出現，提高檢測的準確性；加強實驗室人員技術培訓，加入樣本及試劑量要精準、洗液不能混用，加入量適當，避免洗成“花板”，在限定時間內使用酶標儀讀取結果。近年來，采用全自動酶免分析儀和酶標板快速孵育器相結合，能夠優化操作流程，縮短檢測時間，提高工作效率

。

3.3 應用范圍方面 有的試劑半衰期長，應用范圍僅限于小的實驗室診斷，限制了酶聯免疫吸附檢測法的應用，遠不能滿足臨床分析的需求。對策：ELISA技術的發展趨勢在于優化抗體制備和標記技術，以及研發一些新的免疫分析方法等，研究者應在提高免疫診斷的靈敏度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值等基礎上力求創新，聚焦生命科學和環境科學發展的前沿領域，拓展能夠分析針對生命過程和環境毒理有重要內源性和外源性物質的新方法，促進生命科學、環境科學的研究和發展，以期更好地促進其在醫學上的研發，以便更精準的服務于臨床。

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