基于網絡藥理學探討冬蟲夏草治療糖尿病腎病的作用機制

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)糖尿病患者最主要的合并癥之一，由于其復雜的代謝機制紊亂導致患者一旦達到終末期腎臟病，則治療極為棘手，故而在糖尿病腎病前期有效預防極為關鍵

。冬蟲夏草(cordyceps sinensis，CS)歸肺、腎二經，具有補腎益肺之功效，是我國最名貴的中藥材之一，其藥用價值在近年來廣受追捧，有“百藥之王”的美譽，是我們醫(yī)學領域使用最廣泛的一類中藥材

。目前臨床上廣泛使用人工發(fā)酵的冬蟲夏草菌株(金水寶、百令膠囊) 聯(lián)合血管緊張素受體阻斷劑(ARB)或血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)治療早期糖尿病腎病，延緩其進展，臨床療效顯著

。但是關于冬蟲夏草治療糖尿病腎病主要是從臨床觀察指標出發(fā)，并未從藥理學機制出發(fā)探討冬蟲夏草治療糖尿病腎病的機制。本文從網絡藥理學的機制出發(fā)探討冬蟲夏草對糖尿病腎病的作用機制。

1 資料與方法

1.1 冬蟲夏草的活性成分篩選 本研究通過TCMSP

(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php) 平臺，以“冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)”為關鍵詞搜索其全部活性成分。利用口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，藥物類似性(drug likeness，DL)≥0.18為篩選條件，篩選出冬蟲夏草的活性成分。

1.2 收集冬蟲夏草的相關靶點信息 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中輸入“冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)”，作為關鍵詞搜索，選擇“Related Targets”欄，將“冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)”相關靶點共62個，復制并導出為excle格式，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https：//www.uiprot.org/)中的UniProt Knowledgebase查詢其symbol。

他說：“真的需要在平等基礎上比較所有的成本，即所有能源技術的全部成本，我們應該這樣做，但我們絕對沒有這樣做。”

1.3 獲取糖尿病腎病的相關基因分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫(http：//www.genecards.org/)、CTD數(shù)據(jù)庫(http：//ctdbase.org/)，OMIM數(shù)據(jù)庫(https：//omim.org/)，TTD數(shù)據(jù)庫(http：//db.idrblab.net/ttd/)中輸入“diabetic nephropathy”關鍵詞作為檢索條件，對糖尿病腎病相關的人類基因進行搜索，并將所有疾病基因全部下載取并集共2 987靶點基因，匯總為excle格式。

GO分析發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草對糖尿病腎病的生物學過程主要體現(xiàn)在對脂多糖、細胞代謝反應以及甾醇轉運調節(jié)等，同時有細胞膜、線粒體、外膜等密切參與，主要與相關的酶、蛋白質、受體相結合。

近年來，湖南省自然資源廳精心謀劃研究地理空間大數(shù)據(jù)服務精準扶貧行動計劃,湖南省第二測繪院積極響應，充分整合了第二次全國土地調查、第一次全國地理國情普查、湖南省不動產統(tǒng)一登記1:2000數(shù)字正射影像圖（DOM）基礎成果數(shù)據(jù)等，疊加扶貧辦、民政等部門相關貧困信息數(shù)據(jù)，并通過到十八洞村駐村走訪調查，利用地理信息系統(tǒng)技術，結合北斗定位、遙感監(jiān)測、互聯(lián)網和大數(shù)據(jù)分析等技術，自主設 計研發(fā)了十八洞村精準扶貧管理系統(tǒng)，為十八洞村扶貧業(yè)務管理工作提供了技術支撐，同時為扶貧成效展示宣傳起到了重要作用（如圖1）。

1.6 冬蟲夏草與糖尿病腎病交集靶點功能及生物通路分析 為了進一步探究冬蟲夏草與糖尿病腎病間交集靶點參與的生物學過程和涉及的信號通路，將冬蟲夏草與糖尿病腎病的交集靶點通過R語言插件中的Bioconductor平臺數(shù)據(jù)包中的org.Hs.eg.db對基因進行編碼；再使用R語言插件中的stringi，colorspace 以及Bioconductor 平臺中的clusterProfiler，DOSE，pathview三個數(shù)據(jù)包，進行基因本體(Gene ontology，GO)分析和基于京都基因與基因百科全書(KEGG)信號通路富集分析，并將得出的結果采用可視化分析。

2.1 冬蟲夏草活性成分的篩選 利用TCMSP分析平臺查詢出冬蟲夏草中活性成分38個，以OB≥30%及DL≥0.05為篩選條件，最終得到7個化合物。利用TCMSP平臺中找出各成分對應的靶點信息，冬蟲夏草候選化合物的基本信息及各化合物對應的靶點數(shù)，見表1。

田詩一把抓住姐夫思雨的胳膊，厲聲說：“別把媽吵醒了，還不快回家！”田詩拉著姐夫，風風火火地下了樓，來到大街上招手叫了一輛的士，直奔思雨家而去。

她輕輕翻閱著照片，臉上的神情卻越來越恐懼。因為照片里，是極血腥的殺人現(xiàn)場，那是一個逃生的魔術道具，在一張鐵床上，兩邊豎著可以活動的釘板。被縛住手腳的表演者，會在兩個釘板閉合前，成功逃脫。然而照片里的女人沒有那么幸運，她被死死夾在了釘板中心。

1.7 冬蟲夏草對治療糖尿病腎病的成分- 靶點-信號通路網絡構建 將交集靶點與活性成分的關聯(lián)信息以及交集靶點信號通路相互作用信息導入Cytoscape 3.7.2軟件，建立成分-靶點-通路的信號通路網絡。

2 結果

1.5 交集靶點PPI互作網絡構建 將冬蟲夏草與糖尿病腎病的交集靶點上傳到STRING 10.0(https：//string-db.org/cgi/input.pl)數(shù)據(jù)庫，將物種選擇為“homo sapiens”，構建出冬蟲夏草與糖尿病腎病交集靶點相互作用網絡，從而得出冬蟲夏草與糖尿病腎病交集靶點間的相互作用關系。

2.2 冬蟲夏草與糖尿病腎病的交集蛋白 在TCMSP 分析平臺查詢到的冬蟲夏草蛋白，在GeneCards、CTD、OMIM、TTD四大數(shù)據(jù)庫中查詢到糖尿病腎病靶點共2 987個，并通過在線Venny 2.1.0軟件(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)繪制韋恩圖，冬蟲夏草與糖尿病腎病的交集蛋白共41個，見圖1，并通過Cytoscape 3.7.2軟件構建“疾病-成分-靶點”網絡圖，見圖2。

PPI網絡結果顯示，冬蟲夏草治療糖尿病腎病的關鍵靶點有半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3，CASP3)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase-1，MAPK1)、內皮型一氧化氮合酶(NOS3)、表皮細胞生長因子 (Epidermal Growth Factor、EGF)、應激活化蛋白激酶(JUN)、RELA原癌基因(RELA)等靶點處于冬蟲夏草治療糖尿病腎病關鍵靶點的核心位置。其直接或間接參與了細胞增殖、代謝、凋亡的過程，延緩了糖尿病腎病的進展。其中CASP3在細胞凋亡中的主要蛋白酶之一，在細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)中起關鍵作用，故而CASP3可能直接參與了糖尿病腎病細胞的凋亡過程

。MAPK1是MAPK信號傳導的關鍵分子之一，其亞族主要包括c-Jun 氨基末端激酶(JNK)、細胞外信號調節(jié)激酶1/2(ERK1/2)等，其直接參與糖尿病腎病細胞的生長、分化及凋亡等整個生物學過程

。

蓋瑞特兩級電動壓縮機解決了先前與燃料電池車相關的動力系統(tǒng)尺寸過大的問題。蓋瑞特用其航空航天產品組合中的箔片空氣軸承技術，實現(xiàn)了在汽車行業(yè)中的首次應用。這些軸承由自身的壓縮空氣冷卻，消除了使用任何油或油脂污染燃料電池的潛在可能，確保零排放。蓋瑞特開發(fā)了一種獨特的空氣動力學結構，使用鋁合金葉輪和外殼實現(xiàn)高功率密度性能。高速氣動設計降低機械損失，在整個低速和高速運行范圍內實現(xiàn)超過70%的峰值效率。

2.4 冬蟲夏草與糖尿病腎病的GO功能及KEGG通路分析 通過R語言插件對冬蟲夏草與糖尿病腎病的41個交集靶點進行GO基因本體富集分析和KEGG信號通路富集分析，以

＜0.05為基本設置，分析共得到GO條目863條，其中生物過程(biological process，BP)共775條，細胞組成(cell component，CC)27 條，分子功能(molecular function，MF)61條，根據(jù)的每樣條目P值最小的前10名作圖，如圖4的條形圖和圖5的氣泡圖；KEGG信號通路共133條，選取P值最小的前30名作圖，如圖6的KEGG條形圖和圖7的KEGG氣泡圖，同時選取KEGG 中部分通路如AGEs-RAGEs、TNF、VEGF、p53 等，使用Cytoscape 3.7.2 軟件構建“化合物-通路-靶點”網絡圖，見圖8。

3 討論

糖尿病腎病的發(fā)病原因主要是由于糖尿病患者的血糖控制欠佳導致的，其腎臟血管持續(xù)高血糖刺激下導致腎小球動脈硬化，進而使患者的免疫力下降，導致治療難度加大

。現(xiàn)代中醫(yī)學家將糖尿病腎病歸為“消渴腎病”的范疇，關于本病的中醫(yī)病機，不同醫(yī)家都有各自的見解，但是大多數(shù)醫(yī)家多認為是“本虛標實”之證。本病發(fā)生的基礎為正氣不足，最主要的是先天之氣-腎氣、后天之氣-脾氣的不足，脾腎氣虛則無力促進水液正常的代謝，無力推動血液運行，從而形成瘀血、痰濕等病理產物，因此本病以脾腎虧虛為本，瘀血、痰濕等邪實為標

。冬蟲夏草含有多種腺苷、蟲草素、蟲草酸、麥角甾醇、蟲草多糖以及微量元素，具有補腎益肺、秘精益氣之功效

。相關動物實驗表明冬蟲夏草能夠降低糖尿病腎病大鼠蛋白尿，從而改善腎功能及腎臟組織的相關病理變化

。

本研究通過分析冬蟲夏草活性成分靶點- 網絡，發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草中關鍵化合物主要是花生四烯酸、乙酸芳樟酯、β谷甾醇、膽固醇。其中起主要作用的是花生四烯酸和β谷甾醇。花生四烯酸可對增加血管彈性、酯化膽固醇、改善血液黏度等作用能有效抑制糖尿病腎病患者的進展

。β谷甾醇通過調節(jié)內皮功能、降低膽固醇、提高氧化應激能力等改善腎功能

。

2.3 交集靶點PPI互作網絡構建 為了進一步了解冬蟲夏草候選化合物作用靶點與糖尿病腎病相關蛋白間的交集蛋白的相互作用關系，將“2.2”項下所得的41個交集蛋白上傳至在線STRING 10.0數(shù)據(jù)庫，得出交集蛋白間的相互作用網絡，如圖3所示。圖中共有41個交集蛋白，190條邊，每個蛋白的平均度值為9.27。通過核心靶點篩選條件設置為Degree大于7，共篩選出20個靶點，核心靶點及拓撲參數(shù)見表2。

1.4 冬蟲夏草與糖尿病腎病疾病的靶點基因交集 將所得到的冬蟲夏草靶點基因62個與糖尿病腎病的相關基因2 987個通過VENN網站(https：//bioinfogp.cnb.ic.es/tools/venny/)查詢冬蟲夏草與糖尿病腎病的交集靶點。

KEGG分析得出冬蟲夏草治療糖尿病腎病的信號通路主要通過AGEs-RAGE、TNF、VEGF、p53等信號通路。AGEs-RAGE信號通路，AGEs是指糖尿病患者體內晚期的糖基化終末產物，通過與其受體(receptor of AGEs，RAGE)結合，從而產生一系列的病理編號，是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展最為重要的環(huán)節(jié)。AGEs-RAGE信號通路

一方面可以激活NF-κb，導致大量黏附分子和促炎因子釋放，如IL-6、IL-8和TNF-α，從而導致糖尿病腎病的組織損失和慢性細胞的活化；另一方面可刺激足突細胞的VEGF，誘導血管新生，導致血管通透性增加，誘發(fā)蛋白尿。

VEGF信號通路可直接影響腎小球濾過的功能，并進一步加重糖尿病腎病的進展。足細胞所產生的VEGF能有效維持腎小球的結構和功能，VEGF降低可導致蛋白尿、腎小球損傷、系膜增生、基膜增厚等一系列DN的病理改變

。袁明霞等

發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草可通過降低糖尿病腎病的腎組織VEGF的表達，改善慢性缺氧和血管內皮損失，從而改善腎功能、抑制糖尿病腎病的進展。

p53是重要的抗細胞凋亡的基因，直接參與糖尿病腎病中腎小管上皮細胞衰老病理改變

。臨床研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草可以通過抑制p53的表達，降低腎小管上皮細胞的凋亡，減少蛋白尿起到腎保護的作用

。

“我什么時候惹到你了?”我憤憤地喊道，抓住床單一角使勁把它從床墊上拽了下來，“你難道沒發(fā)現(xiàn)嗎?我們現(xiàn)在是同一派別!”

TNF是是一種重要的免疫調節(jié)細胞因子，也是主要的促炎細胞因子之一，在炎癥介導中發(fā)揮著重要的作用。目前TNF被認為是在高血糖或糖尿病狀態(tài)下多種生理病理的改變以及導致DKD共同的最終的中介物質，特別是對微血管的病變具有多樣性效應

。實驗研究表明冬蟲夏草可以通過下調TNF的炎癥因子轉錄，起到腎保護的作用

。臨床試驗研究也表明冬蟲夏草可以從免疫干預、抑制腎臟纖維化，減輕濾過膜壓力起到腎保護作用，延緩糖尿病腎病的進展

。

綜上所述，基于網絡藥理學分析認為冬蟲夏草中的可能通過花生四烯酸、乙酸芳樟酯、β谷甾醇、膽固醇作用于AGEs-RAGE 信號通路、P53信號通路、VEGF信號通路、TNF信號通路等通路作用于CASP3、MAPK1、NOS3等靶點，發(fā)揮抗炎、抗氧化、增加血氧飽和度等作用。因此，冬蟲夏草通過“多成分- 多靶點- 多通路”的共同作用治療糖尿病腎病。鑒于網絡藥理學的局限性，后期還需進一步對冬蟲夏草的潛在活性成分、作用靶點及通路進行實驗驗證。

[1] 童國玉，朱大龍.糖尿病腎病國內外臨床指南和專家共識解讀[J]. 中國實用內科雜志，2017，37 (3)：211-216.

[2] YANG P，ZHAO X，ZHANG Y.Comparison and review on specifications of fermented Cordyceps sinensis products[J].Zhongguo Zhong yao za zhi，2018，43(3).1102.

[3] 于文會，段書眾，臧亞茹，等.百令膠囊聯(lián)合氯沙坦鉀片對慢性腎臟病患者相關炎性因子的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2020，29(8)：819-822.

[4] 劉暢，郭明星.金水寶聯(lián)合氯沙坦對老年糖尿病腎病患者氧化應激反應及腎功能的影響[J].中國老年學雜志，2020，40(18)：3846-3849.

[5] 汝錦龍.中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺的構建和應用[D].陜西：西北農林科技大學，2015.

[6] SALAHUDDIN A S.Update on Diagnosis and Management of Early Stage Diabetic Kidney Disease[J].American Journal of Medicine and Medical Sciences，2019，9(3)：1056-1057.

[7] 于淼，王秀閣，李瑞恩，等.淺談糖尿病腎病中醫(yī)病機[J].新中醫(yī)，2020，52(18)：186-189.

[8] 楊建鑫，李向陽.冬蟲夏草活性成分蟲草多糖的研究進展[J].中藥材，2019，42(4)：935-940.

[9] ZHONGHUA D，YUEYUE S，GUANGWEI W，et al.A Nucleoside/Nucleobase-Rich Extract from Cordyceps Sinensis Inhibits the Epithelial- Mesenchymal Transition and Protects against Renal Fibrosis in Diabetic Nephropathy [J].Molecules，2019，24(22)：107-201.

[10] EID S，ABOU-KHEIR W，SABRA R，et al.Involvement of renal cytochromes P450 and arachidonic acid metabolites in diabetic nephropathy [J].Journal of biological regulators and homeostatic agents，2013，27(3)：798.

[11] HE D，HUANG J，ZHANG Z，et al.A Network Pharmacology-Based Strategy For Predicting Active Ingredients And Potential Targets Of LiuWei DiHuang Pill In Treating Type 2 Diabetes Mellitus[J].Drug design，development and therapy，2019(13)：1020.

[12] 張春.Angiopoietin-1 及L-mimosine 對糖尿病大鼠腎臟固有細胞凋亡的影響[D].遵義：遵義醫(yī)學院，2017.

[13] WANG B，YAO K，WISE A F，et al.miR-378 reduces mesangial hypertrophy and kidney tubular fibrosis via MAPK signalling[J].Clinical science(London，England：1979)，2017，131(5)：705.

[14] 楊超茅，楊志新，馬曉玲.AGEs-RAGE 信號通路在糖尿病腎病中的作用機制及中醫(yī)藥研究進展[J].中醫(yī)學報，2019，34(9)：1864-1868.

[15] YUAN-YE Q，LI-QIN T，WEI W.Berberine exerts renoprotective effects by regulating the AGEs-RAGE signaling pathway in mesangial cells during diabetic nephropathy[J].Molecular and Cellular Endocrinology，2017(5)：443.

[16] THE S W J.Retracted：VEGF Genetic Polymorphisms May Contribute to the Risk of Diabetic Nephropathy in Patients with Diabetes Mellitus：A Meta-Analysis[J].The Scientific World Journal，2020(10)：648.

[17] 何小魁，王勝來，田子亮，等.血清血管內皮生長因子及同型半胱氨酸水平與2 型糖尿病患者微血管病變的關系[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2020，43(6)：628-634.

[18] 袁明霞，唐榮，周巧玲，等.冬蟲夏草對糖尿病腎病大鼠腎組織HIF-1α 及VEGF 表達的影響[J].中南大學學報(醫(yī)學版)，2013，38(5)：448-457.

[19] FUZHE M，JUNDUO W，ZIPING J，et al.P53/NRF2 mediates SIRT1's protective effect on diabetic nephropathy[J].BBAMolecular Cell Research，2019，4(8)：106.

[20] CRAIG E H，JIAQI T，BADAR M M，et al.TGF-β1-p53 cooperativity regulates a profibrotic genomic program in the kidney：molecular mechanisms and clinical implications [J].The FASEB Journal，2019，33(10)：102.

[21] 周巧玲，唐榮，朱俐俐，等.冬蟲夏草對自發(fā)性高血壓大鼠腎臟Klotho 表達和腎小管上皮細胞凋亡的影響[J].中華腎臟病雜志，2009(4)：305-312.

[22] HEMALATA D，SHARMA P.Experimental Diabetic Nephropathy is Associated with Increased Expression of Inflammatory Proteins in the Kidney [J].The FASEB Journal，2020，34(Suppl1)：106.

[23] WENXING F，ZHANG L，HUA X，et al.Therapeutic efficacy of liraglutide on diabetic nephropathy mice by inhibiting inflammatory factors [J].European Journal of Inflammation，2018(16)：102.

[24] 黃仁發(fā)，李賀生，梁群卿，等.冬蟲夏草對腎缺血- 再灌注損傷大鼠血清和肺泡TNF-α、IL-1β 以及腎和肺組織水通道蛋白1 表達的影響[J].中國中西醫(yī)結合雜志，2018，38(7)：844-850.

[25] 劉春燕，陳云霞，蘇俊平，等.百令膠囊對糖尿病腎病患者單核細胞Toll 樣受體4 表達及炎性因子的影響[J].河北醫(yī)藥，2015，37(24)：3703-3706.