基于發(fā)病機制分析2 型糖尿病周圍神經(jīng)病變的關(guān)鍵基因及重要通路

陳曉毓，馬匠心，張海濱，陳旎瑤，劉清權(quán)

1.福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，福建泉州 362000；2.福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，福建泉州 362000

據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會估計，2021 年全球成年糖尿病患者數(shù)為5.37 億[1]。我國糖尿病患病率居全球首位[2]，患病率為12.4%[3]，糖尿病前期患病率達 35.7%[4]。糖尿病可發(fā)生多種并發(fā)癥，糖尿病周圍神經(jīng)病病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）為常見并發(fā)癥，但DPN 的發(fā)病機制復雜。到目前為止，具體機制尚不清楚。隨著二代測序技術(shù)發(fā)展，DPN相關(guān)基因調(diào)控受到關(guān)注。研究表明Toll 樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)是2 型糖尿病神經(jīng)病變（type 2 diabetic peripheral neuropathy,T2DPN）的候選保護基因，與患病率密切相關(guān)[5]。但對DPN 缺乏系統(tǒng)性調(diào)控機制的研究，通過生物信息學分析探索疾病機制是有效手段。本研究從GEO 數(shù)據(jù)庫下載了包含正常人、DPN 患者外周血的基因芯片，利用生物信息學技術(shù)，分析得到兩者相關(guān)的差異表達基因，篩選出關(guān)鍵核心基因，并對2021 年6—12 月福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的T2DPN患者20 例和體檢中心健康人18 名的外周血淋巴細胞的表達進行驗證，為DPN 發(fā)生機制以及治療提供新的思路。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載GSE95849 數(shù)據(jù)集，該芯片數(shù)據(jù)包括6 例2型DPN 患者和6 名正常人。

1.2 DEG 識別和功能富集

用R 語言對表達數(shù)據(jù)進行標準化處理，再用limma 包分析正常樣本和DPN 樣本的差異表達基因，差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）的篩選標準是：|logFC|≥2 及P＜0.05。

對獲得的差異基因，利用DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO 和KEGG 功能富集分析，富集通路定義為P＜0.05。

1.3 核心基因篩選

利用STRING 在線數(shù)據(jù)庫（http://www.string-db.org/）預測DEG 對應蛋白的互作關(guān)系，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（設(shè)置combined score＞0.4）。STRING 分析結(jié)果用Cytoscape 3.8.0.軟件進行可視化，并使用Cytohubba 對PPI 網(wǎng)絡(luò)再次分析核心基因的篩選，具體為：通過Cytohubb 確定Betweenness、Degree、Closeness、EPC、MCC 5 種計算法獲得top10 的基因，并取這些基因的交集獲得關(guān)鍵基因。

1.4 一般資料

選取本院內(nèi)分泌科住院的T2DPN 患者18 例和體檢中心健康人名20 名，分為疾病組和對照組。其中疾病組即DPN 組，男13 例，女5 例；平均年齡（57.9±8.3）歲。對照組即健康組，男16 名，女4 名；平均年齡（47.7±9.8）歲。所有患者均簽署了研究知情同意書，且研究通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準。

1.5 納入與排除標準

納入標準：知情同意；明確診斷T2DPN；能夠積極配合調(diào)查與試驗。

排除標準：合并其他嚴重糖尿病并發(fā)癥者；精神疾病者；惡性腫瘤者；1 型糖尿病者；家族遺傳疾病者；基因缺陷病者。

1.6 RNA 提 取與qRT-PCR 驗證

收集年齡與性別相匹配的DPN 及健康人外周血標本18 例和20 名。所有參與者均簽署了知情同意書后采集血樣，再遵循protocal 試劑制造商的協(xié)議加入人外周血淋巴細胞分離液后離心，將提取出的PBMC 加入無血清細胞凍存液后存于-80℃冰箱，再提取出人外周血淋巴細胞總RNA，再用TAKARA試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后按照TB Green Premix EX Taq（Tli RNaseH）均勻加樣、離心、標記后放入PCR 儀中進行擴增后電泳檢測，再以GAPDH 為內(nèi)參，用2-ΔΔCT 相對定量法分析待測基因的轉(zhuǎn)錄水平。所用引物序列，見表1。

表1 qRT-PCR 使用引物序列

1.7 統(tǒng)計方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，以中位數(shù)和四分位距（25%和75%位數(shù)）表示，采用秩和檢驗（雙側(cè)）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2. 1 數(shù)據(jù)預處理及DEGs 的篩選

預處理結(jié)果如下：共包含12 例樣本，其中正常外周血樣本6 例，2 型糖尿病外周血樣本6 例，基于篩選標準 |logFC|≥2 及P＜0.05，見圖1。

圖1 627 個DEGs 基因表達火山圖。

2.2 DEGs 的功能富集分析

KEGG 分析結(jié)果顯示差異表達基因主要和PI3K-Akt 信號通路等過程有關(guān)，基因比例與數(shù)目均明顯高于其他途徑。見圖2。

圖2 KEGG 分析結(jié)果顯示DEGs 所涉及的信號通路

2.3 DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及核心基因的確定

基于DEGs 分析結(jié)果利用PPI 網(wǎng)絡(luò)在其中挑選出了TLR4 核心基因，并經(jīng)qRT-PCR 實驗證實TLR4核心基因在周圍神經(jīng)病變后表達升高（P=0.038）。見圖3，4。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖形

韋恩圖最終確定了PPI 網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置的4 個核心基因分別是CSF1R、SELL、TLR4、TNF。

2.4 qRT- PCR 驗證核心基因（TLR4）

疾病組與正常組各18 和20 個樣本，經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學意義（P=0.038）。結(jié)果與前述分析結(jié)果相一致。見圖5。

圖5 TLR4 qRT-pcr 驗證結(jié)果

圖4 核心基因韋恩圖

3 討論

有研究表明TLR4 是2 型糖尿病和相關(guān)神經(jīng)病變的候選保護基因，與T2DPN 患病率降低密切相關(guān)，但都缺乏系統(tǒng)的生物信息學分析。因此，重點運用生物信息學的方法對結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)構(gòu)成核心基因的為TLR 家族成員的TLR4，并進一步通過qRT-PCR 驗證核心基因。

本研究發(fā)現(xiàn)，與健康組相比，DPN 患者在單核細胞中TLR4 的表達明顯升高(P=0.038)。結(jié)果表明，TLR4 關(guān)鍵基因?qū)2DPN 的發(fā)病機制有著巨大的意義。TLR4 基因是被廣泛研究的TLR 家族的代表，近幾年研究表明TLR4 是促進巨噬細胞活化、細胞因子釋放和組織損傷的主要受體。這種受體的存在可能表明先天調(diào)節(jié)的異常調(diào)節(jié)免疫，它有助于促炎介質(zhì)的產(chǎn)生和疾病的發(fā)展。其具體機制包括：TLR4 觸發(fā)細胞內(nèi)信號級聯(lián)，產(chǎn)生趨化因子，啟動和控制關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，并觸發(fā)和放大炎癥因子反應，介導腸腔內(nèi)抗原作為脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的識別[6]，隨后LPS 與TLR4 結(jié)合后，誘導TLR4 的下游信號通路可激活其下游髓系分化初級反應蛋白88(MyD88)和核因子-κB(nuclear factor-kappaB,NFκB)[7]，并通過MyD88 的募集抑制PI3K-Akt 通路[8]，而PI3K/AKT 通路有助于脊髓損傷后的神經(jīng)功能恢復[9]，通過抑制其恢復作用使炎癥過程持續(xù)下去。也有越來越多的證據(jù)表明，TLR4/Myd88/NF-κB 和PI3K-Akt 信號通路之間存在串擾，激活PI3K/AKT信號通路可以抑制TLR4/NF-κB 信號通路[10]。神經(jīng)毒性可導致神經(jīng)元損傷和凋亡，并最終引起神經(jīng)病變，但這種作用可以通過激活PI3K-Akt 信號通路而得到抑制，因此可預測：TLR4 基因與T2DPN 的發(fā)病機制密切相關(guān)[11]。

近幾年來，關(guān)于TLR4 基因的研究越來越受到關(guān)注，很多研究者進一步研究發(fā)現(xiàn)TLR4 基因作為高遷移率組盒-1(high-mobility group box 1,HMGB1)警報蛋白的關(guān)鍵受體形成的HMGB1/TLR4 信號通路軸通過釋放的細胞外HMGB1 與TLR4 相互作用，激活炎癥通路，刺激體內(nèi)的炎癥反應[12]。此次研究預測HMGB1/TLR4 信號通路與DPN 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

結(jié)合前述研究和驗證本文可得出結(jié)論：HMGB1/TLR4 信號通路與DPN 的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)。但未對此信號通路的完整通路進行研究和驗證，可能是尚未發(fā)掘新的發(fā)病機制，若進一步深入研究可為T2DPN 精準治療提供新的診療方向。