N-甲基-D-天冬氨酸受體在腦創(chuàng)傷介導(dǎo)急性肺損傷過(guò)程中的作用

周松，樓穎穎，錢(qián)梅姿

顱腦創(chuàng)傷（TBI）可導(dǎo)致全身多系統(tǒng)損害和功能紊亂[1]，其中腦創(chuàng)傷介導(dǎo)的急性肺損傷（TBI-ALI）是其常見(jiàn)的并發(fā)癥，致病率達(dá)20%～25%[2]。同時(shí)肺損傷也是TBI繼發(fā)死亡的主要原因之一，這類(lèi)患者的致殘率和病死率是未合并TBI-ALI的1.5～2倍，嚴(yán)重影響著TBI患者的轉(zhuǎn)歸[3]。N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）是神經(jīng)系統(tǒng)中的一種興奮性谷氨酸受體，當(dāng)興奮性氨基酸谷氨酸增多時(shí)，可激活NMDAR介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，通過(guò)引起Ca2+超載而激活細(xì)胞內(nèi)一系列機(jī)制介導(dǎo)細(xì)胞死亡，參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，NMDAR亦可通過(guò)擴(kuò)大炎性反應(yīng)的進(jìn)展加劇肺損傷過(guò)程[5]。本研究將通過(guò)激活和抑制NMDAR，探究其在TBI-ALI模型中的作用機(jī)制。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 清潔級(jí)C57BL/6小鼠40只，體質(zhì)量21～22 g，8周齡，購(gòu)買(mǎi)于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。術(shù)前12 h禁食，自由飲水。本研究獲溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（wydw 2020-0537）。

1.2 方法

1.2.1 分組 隨機(jī)將小鼠分為4組（n=10）：正常對(duì)照組（Sham組）、腦損傷組（TBI組）、TBI+谷氨酸注射組（TBI+Glu組）及TBI+MK-801組（TBI+MK-801組）。

1.2.2 模型制備 采用控制性皮層沖擊法制備TBI模型[6]。首先通過(guò)1.5%戊巴比妥鈉（0.1ml）進(jìn)行麻醉，選擇小鼠前囟和“人”字縫之間左側(cè)顱骨的位置，剪開(kāi)皮膚約1 cm暴露顱骨，打開(kāi)骨膜，穩(wěn)定小鼠頭部后持鉆進(jìn)行左側(cè)顱骨鉆孔。當(dāng)有明顯落空感時(shí)停止鉆孔，隨后將小鼠置于腦立體定位儀上固定，選定打擊參數(shù)為深度2mm，時(shí)間100 ms，速度3.5 m/s。打擊后立即將小鼠取下并置于保溫毯上恢復(fù)。密切觀察記錄小鼠生命體征，待呼吸平穩(wěn)后方可縫合傷口并放回籠內(nèi)飼養(yǎng)。Sham組除不打擊外，其余操作與TBI組相同。谷氨酸（Solarbio G0010 1mg/kg）及MK-801（MedChemExpress HY-15084 0.1 mg/kg）分別于造模后半小時(shí)和造模前半小時(shí)腹腔內(nèi)注射。Sham組和TBI組腹腔內(nèi)注射等量0.9%氯化鈉注射液。

1.2.3 標(biāo)本處理 小鼠造模后24 h取小鼠右肺上葉做干濕比，右肺下葉用4%多聚甲醛固定后制作病理切片，小鼠左肺組織用于免疫蛋白檢測(cè)。取小鼠肺泡灌洗液用于炎癥因子檢測(cè)。

1.2.4 肺組織HE染色 取小鼠右下肺組織，4%多聚甲醛固定24 h后制備成石蠟切片后行HE染色。在×200放大倍數(shù)下，隨機(jī)取3個(gè)視野進(jìn)行觀察，評(píng)分由2名實(shí)驗(yàn)員通過(guò)雙盲的方法進(jìn)行評(píng)估。評(píng)分細(xì)則由4個(gè)相對(duì)獨(dú)立的方面：肺泡腔充血、血管出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況及肺泡壁厚度。0分：代表正常肺組織；1分：代表輕微損傷，損傷程度＜25%；2分：代表中度損傷，損傷程度25%～50%；3分：代表重度損傷，損傷程度50%以上至75%；4分：代表極重度損傷，損傷程度＞75%。通過(guò)累加各指標(biāo)得分為T(mén)BIALI總得分，取3個(gè)視野的平均值。

1.2.5 肺組織干濕比測(cè)定 采用眼科剪剪取右肺上葉一小塊新鮮肺組織，將其置于體重秤進(jìn)行濕重稱(chēng)量。將組織置于65℃烤箱中烘干，等待24 h，肺組織重量不再改變時(shí)記錄此時(shí)干重。肺組織干濕比重采用濕重/干重來(lái)表示，反應(yīng)肺部水腫情況。

1.2.6 肺泡灌洗液處理 麻醉下仰臥位固定小鼠，采用眼科剪及蚊式直鉗小心游離氣管周?chē)M織后充分暴露小鼠氣管。用5ml注射器針頭去尖頭后在甲狀軟骨上方進(jìn)行氣管插管，并用縫線將其固定。1ml注射器每次灌注1ml無(wú)菌PBS并重復(fù)3次，確?；匚蔬_(dá)到90%以上。將收集到的肺泡灌洗液進(jìn)行離心1 000 r/min，5 min；其余上清液－80℃保存。用ELISA法測(cè)支氣管肺泡灌洗液上清中腫瘤壞死因子（TNF-）、白介素-1（IL-1）及白介素-10（IL-10）炎癥指標(biāo)。ELISA試劑盒TNF-、IL-1及IL-10均購(gòu)自美國(guó)Ebioscience。

1.2.7 肺組織相關(guān)蛋白測(cè)定 提取左肺組織蛋白，置－80℃保存。BCA法測(cè)定蛋白濃度，取總量50g蛋白進(jìn)行上樣，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉。隨后條帶置于TBST液中清洗3次，轉(zhuǎn)移至一抗抗體孵育盒中，4℃搖床孵育至少8 h以上。一抗?jié)舛龋恨D(zhuǎn)錄因子p-NFAT（美國(guó)Invitrogen PA5-38301 1∶1 000）、血管內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1，美國(guó)Abcam AB179707 1∶1 000）及ACTIN（美 國(guó)Abcam AB8227 1∶2 000）。一抗孵育結(jié)束后，將條帶轉(zhuǎn)移至TBST中清洗3次，搖床上緩慢搖動(dòng)，10 min/次。常溫孵育二抗2h后采用ECL法進(jìn)行曝光。曝光后的條帶采用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS23.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用F檢驗(yàn)，多重比較采用Turkey檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)肺損傷病理組織學(xué)的影響 Sham組呈現(xiàn)了正常的肺組織表現(xiàn)；小鼠TBI造模后，肺組織出現(xiàn)了典型的炎癥病理反應(yīng)，表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)聚集，肺泡壁增厚，肺泡腔出血及肺組織間隙水腫等。在TBI+Glu組，谷氨酸進(jìn)一步激活NMDAR后，肺損傷積分較單純TBI組更高（t=6.72，P＜0.05）。使用NMDAR阻斷劑MK-801后，小鼠TBI后的肺損傷明顯減輕，與Sham組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=1.34，P＞0.05）。見(jiàn)封二彩圖1～2。

2.2 NMDAR的激活對(duì)肺組織干濕比影響 TBI小鼠造模后肺組織干濕比較Sham組明顯增加（t=6.14，P＜0.05），TBI+Glu組干濕比較TBI組進(jìn)一步增加（t=2.59，P＜0.05）；使用MK-801的TBI小鼠干濕比較TBI組發(fā)生下降，與Sham組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.45，P＞0.05）。見(jiàn)封二彩圖3。

2.3 肺組織中炎癥因子TNF-、IL-1及IL-10的變化 TBI組TNF-、IL-1及IL-10水平均高于Sham組（t≥4.28，均P＜0.05）。TBI+Glu組小鼠TNF-、IL-1及IL-10水平均高于TBI組（t≥2.48，均P＜0.05）。TBI+MK-801組小鼠TNF-、IL-1及IL-10水平與Sham組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t≤1.85，均P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 肺組織中炎癥因子TNF-、IL-1及IL-10的變化（=10）pg/ml

2.4 肺組織中p-NFAT及ICAM-1蛋白變化 免疫蛋白學(xué)結(jié)果顯示，TBI組p-NFAT表達(dá)較Sham組下降，但I(xiàn)CAM-1表達(dá)量增加（t=4.11、4.51，均P＜0.05）。TBI+Glu組小鼠p-NFAT較TBI組下降，ICAM-1表達(dá)量卻增加（t=7.00、4.81，均P＜0.05）。TBI+MK-801組小鼠2種蛋白表達(dá)與Sham組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t≤0.48，均P＞0.05）。見(jiàn)封二彩圖4。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，TBI后小鼠可發(fā)生TBI-ALI，表現(xiàn)為造模后小鼠肺組織干濕比、肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-、IL-1及IL-10表達(dá)增加，肺組織病理?yè)p傷加重。注射谷氨酸后肺損傷較單純TBI組加重，而MK-801的使用則減輕了肺損傷的發(fā)生。此外，通過(guò)蛋白檢測(cè)肺組織中p-NFAT以及ICAM-1的改變，證明NMDAR加劇肺損傷過(guò)程與激活內(nèi)皮細(xì)胞中NFAT信號(hào)通路相關(guān)。

TBI-ALI發(fā)生的機(jī)制多種多樣，其中爆破理論以及滲透性損傷理論被廣泛接受[7]。全身炎癥系統(tǒng)反應(yīng)在TBI-ALI中發(fā)揮著重要作用，TBI可通過(guò)增加顱內(nèi)炎癥因子的釋放入血到達(dá)外周器官引起損傷，又可通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞到達(dá)靶器官，引起靶器官內(nèi)炎癥因子的表達(dá)[8]。本實(shí)驗(yàn)采用控制性皮層損傷構(gòu)建小鼠TBI模型，通過(guò)檢測(cè)肺組織干濕比改變，BALF液中炎癥因子表達(dá)及肺組織HE染色，發(fā)現(xiàn)TBI組較Sham組干濕比增加，且炎癥因子TNF-、IL-1及IL-10表達(dá)也上升。此外，TBI組小鼠肺組織HE染色發(fā)現(xiàn)肺泡間隔炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，出血和水腫較Sham組嚴(yán)重。以上結(jié)果表明TBI模型建立，并成功誘導(dǎo)了TBI-ALI的發(fā)生，且其與炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)。

NMDAR作為一種谷氨酸離子型受體，不僅存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，在腎、肺、胰島 細(xì)胞以及血管等組織中均有表達(dá)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，血液中谷氨酸水平與TBI-ALI的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TBI+Glu組肺組織損傷較單純TBI組發(fā)生明顯的加重，表現(xiàn)為干濕比的增加，炎癥因子TNF-、IL-1及IL-10表達(dá)上升，病理組織學(xué)評(píng)分的增高。而予抑制劑MK-801后，通過(guò)阻斷NMDAR在肺組中的作用，TBI組小鼠肺組織較單純TBI組減輕，與Sham組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。進(jìn)一步闡明了NMDAR在TBI-ALI模型中的興奮性作用，而阻斷NMDAR則可抑制炎癥因子的產(chǎn)生，從而對(duì)肺損傷起到保護(hù)作用。

轉(zhuǎn)錄因子NFAT首次在激活的T細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，以磷酸化的形式存在于靜息狀態(tài)下，而當(dāng)鈣調(diào)蛋白磷酸酯酶Calcineurin和NFAT激酶結(jié)合時(shí)，NFAT的磷酸化狀態(tài)改變并被激活，隨即入核促進(jìn)下游炎癥基因的表達(dá)[11]。NFAT介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路與肺損傷有著密切聯(lián)系，NMDAR是NFAT的重要上游調(diào)節(jié)機(jī)制，兩者通過(guò)Ca2+信號(hào)傳遞樞紐，共同參與神經(jīng)細(xì)胞的活性調(diào)節(jié)[12]?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，本實(shí)驗(yàn)對(duì)NFAT在TBI-ALI發(fā)生過(guò)程中的作用進(jìn)行探究。結(jié)果顯示，TBI組及TBI+Glu組p-NFAT較Sham組發(fā)生了下降，其中以TBI+Glu組下降更明顯，提示NFAT轉(zhuǎn)錄因子在TBI組以及TBI+Glu組中被激活。ICAM-1在TBI組及TBI+Glu組表達(dá)較Sham組增加，其中TBI+Glu組增加更多。可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷較Sham組嚴(yán)重。在TBI+MK-801組，兩種蛋白與Sham組表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），表明炎癥反應(yīng)在使用NMDAR抑制劑MK-801后被抑制且內(nèi)皮細(xì)胞得到了保護(hù)。進(jìn)一步證明NMDAR的激活加劇了TBI-ALI的發(fā)生，且此過(guò)程可能與內(nèi)皮細(xì)胞中NFAT被激活產(chǎn)生炎癥因子相關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了TBI-ALI損傷過(guò)程中的新機(jī)制，即NMDAR可激活內(nèi)皮細(xì)胞中NFAT，使其促進(jìn)大量炎癥因子的表達(dá)從而介導(dǎo)肺損傷的發(fā)生。因此，有效阻斷NMDAR在TBI-ALI產(chǎn)生過(guò)程中的作用，可減少炎癥因子的產(chǎn)生，盡早避免肺損傷的發(fā)生。