微組織修復大鼠坐骨神經缺損的早期實驗研究

張 健，李超超，孟繁琪，管延軍，楊博堯，張鐵元，任致奇,4，劉修志，趙 杰，楊凱，王 玉，彭 江 解放軍醫學院，北京 0083； 解放軍總醫院 骨科研究所，北京 0083；北京大學人民醫院 脊柱外科，北京 00044；解放軍總醫院 神經外科，北京 0083； 北京清華長庚醫院 血管外科，北京08； 解放軍 938部隊醫院，河北張家口 07000

周圍神經損傷 (peripheral nerve injury，PNI)發病率高，占創傷患者的2.8%，全世界每年至少有200萬人患PNI[1-3]。當存在長節段神經缺損時直接端端吻合效果較差[4]。作為長段神經缺損治療“金標準”的自體神經移植 (autogenous nerve grafting，ANG)有其局限性，包括供體受體神經尺寸不匹配、供區神經來源有限、需要兩次手術、供區去神經功能障礙等[5]。近年來，組織工程技術的快速發展為PNI提供了一種新的治療方法。傳統組織工程采用Top-Down策略：先在體外構建與受體區域大小、形狀相同的支架，然后把高密度種子細胞添加到支架中從而構建組織工程移植物[6-8]。然而這種策略其局限性，如：傳統二維培養細胞在使用前需要胰酶消化，這會破壞細胞的細胞外基質 (extracellular matrix，ECM)和微環境，降低細胞活性[9-10]；單個細胞移植到受體區域后容易受缺血、炎癥等因素的干擾，導致細胞丟失或死亡[11]。為解決以上問題，一種新的組織工程策略——Bottom-Up策略(組織工程微組織策略)應運而生。目前微組織尚無明確定義，通常是指種子細胞在細胞-細胞或細胞-ECM作用下聚集而成的微型組織[12]。微組織具有以下優點：1)微組織是細胞聚集形成的微型組織，在植入體內后可使細胞免受炎癥、缺血等因素的影響[13]；2)微組織的結構特征與自然組織相似，為細胞增殖分化提供了良好的微環境[14-16]；3)微組織中的細胞處于三維空間環境中，這種3D培養方式有利于提高細胞活性[17-18]。微組織策略在骨組織工程[19]、軟骨組織工程[20]、脂肪組織工程[17]、心肌組織工程[21]、血管組織工程[22]、腫瘤學[23]等領域均取得了突破性的研究進展。然而，在神經組織工程中微組織的研究較少，因此本研究嘗試使用微組織進行PNI修復。在體外構建微組織，評價微組織對背根神經節 (dorsal root ganglia，DRG)軸突生長的作用；在體內使用微組織聯合聚己內酯(polycaprolactone，PCL)神經導管構建神經移植物，修復大鼠坐骨神經1 cm缺損模型，術后4周對神經移植物進行組織學評價。

材料與方法

1 實驗動物 健康雌性 SD 大鼠 24 只，8 周齡，體質量 200 ~ 250 g，用于構建坐骨神經 1 cm 缺損模型。健康SD大鼠5只，3 d齡，用于提取脂肪來源間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ASCs)。健康 SD 大鼠 3 只，1 d 齡，用于提取DRG。所有動物由解放軍總醫院動物實驗中心提供，獲解放軍總醫院實驗動物倫理委員會批準(批準號：2016-x9-07)。

2 主 要 試 劑 Ⅱ 型 膠 原 酶 (Sigma)；DMEM(Gibco)；FBS(Corning)；PBS(Gibco)；青鏈霉素溶 液(Gibco)；0.25% 胰 蛋 白 酶-EDTA(Gibco)；CD34抗體(Novus)；CD105抗體(Novus)；CD45抗體(BDPMG)；CD90抗體(BDPMG)；CD73抗體(BIORBYT)；低黏附細胞培養板(Corning)；Transwell培養板(Corning)；PKH26試劑盒(Sigma)；Neurobasal培養基(Gibco)；GlutaMAX溶液(Gibco)；B27溶液(Gibco)；10%山羊血清(Solarbio)；兔來源S100單克隆抗體(Sigma)；小鼠來源NF200單克隆抗體 (Sigma)；山羊抗兔 IgG/Alexa Fluor?594(Abcam)；山羊抗小鼠IgG/Alexa Fluor?488(Abcam)；DAPI染色液(碧云天)；聚己內酯(polycaprolactone，P CL；Sigma)；六氟異丙醇(Sigma)。

3 大鼠 ASCs 的提取和鑒定 從 3 d 齡 SD 大鼠腹股溝區脂肪組織中分離提取ASCs。將腹股溝區脂肪組織剪成1 mm3碎塊，在37℃下用含0.1%Ⅱ型膠原酶的DMEM溶液消化30 min。使用含10% FBS的DMEM溶液終止消化后使用濾網過濾，離心后加入含10% FBS、青鏈霉素的DMEM培養基重懸細胞后置入37℃、5% CO2細胞培養箱中培養，48 h后更換培養基。當細胞達到80%融合時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA進行消化，以1∶2傳代，P2或P3代ASCs用于后續實驗。取狀態較好的P3代ASCs，使用流式細胞儀檢測細胞表面標志物CD45、CD34、CD73、CD105、CD90，觀察各標志物表達陽性率。

4 兩種微組織構建方法的探索 我們分別使用懸浮液滴法和低黏附細胞培養板法構建微組織。對于懸浮液滴法，在培養皿的蓋子上均勻滴上細胞懸液(1×104/70 μL)，隨后將蓋子翻轉蓋于培養皿之上，3 d后對微組織進行觀察并拍照。對于低黏附細胞培養板法，這種特殊的細胞培養板底部覆蓋了一層低黏附的聚苯乙烯，可以防止細胞貼壁，經過一段時間后細胞可相互聚集形成微組織。在低黏附細胞培養板的每個孔中加入細胞懸液 (1×104/70 μL)，3 d 后對微組織形態進行觀察并拍照。

5 微組織形態的觀察 經過上述實驗，我們發現懸浮液滴方法構建的微組織結構松散，故使用低黏附細胞培養板法構建的微組織進行后續實驗。分別使用三種細胞濃度(0.5×104/70 μL、0.75×104/70 μL、1×104/70 μL)進行為期 7 d 的微組織形態動態觀察，并拍照。使用Image-Pro Plus軟件測量微組織直徑并進行統計分析(含1×104個細胞的微組織進行后續實驗)。

6 微組織與 DRG 的間接共培養 為了在體外探究微組織對神經再生的作用，我們將微組織與DRG進行間接共培養和直接共培養，以觀察其對軸突生長的作用。實驗前我們首先提取1 d齡SD大鼠DRG，取出脊柱沿正中線分成左右兩半，在顯微鏡下小心取出雙側椎間孔中的DRG，剝除外膜置于含GlutaMAX?和B-27?的Neurobasal培養基中待用。使用Transwell系統進行間接共培養實驗，將DRG置于下層小室中，上層小室分別加入微組織、2D培養的ASCs和無細胞培養基(對照組)，其中微組織組(50個微組織)和2D組(5×105個細胞)具有相同數量的ASCs。加入充足的DRG培養基培養7 d后對DRG進行免疫熒光染色。將DRG進行甲醛固定、PBS清洗、10%山羊血清封閉，使用兔來源S100單克隆抗體和小鼠來源NF200單克隆抗體在4℃下孵育DRG過夜。第2天用PBS清洗后使用山羊抗兔IgG/Alexa Fluor?594 和山羊抗小鼠 IgG/Alexa Fluor?488 在室溫下孵育DRG 2 h。隨后PBS清洗，DAPI工作液孵育5 min。使用熒光顯微鏡對DRG拍照，觀察軸突長度，使用Image-Pro Plus進行測量(每組隨機選取4個DRG，每個象限選取最長的兩根軸突)并進行統計分析。

7 組織與 DRG 的直接共培養 為了探究微組織與DRG之間是否存在直接相互作用，我們將微組織與DRG進行直接共培養。為了方便觀察，首先使用PKH26染料對ASCs進行染色。簡單地說，ASCs經消化、離心后，用稀釋緩沖液重懸，將細胞懸液倒入染色工作液中。加入FBS終止染色，用ASCs培養基清洗3次，隨后將pKH26-ASCs構建成微組織待用。將PKH26-ASCs微組織與DRG置入細胞培養皿中，加入足量的DRG培養基，共培養7 d后進行NF200和DAPI免疫熒光染色，使用熒光顯微鏡觀察兩者之間是否存在直接相互作用并拍照。

8 取向性聚己內酯導管的構建及其取向性驗證將PCL溶解于六氟異丙醇中，在25℃下攪拌12 h獲得8%(w/v)溶液。將溶液置入靜電紡絲機噴頭處的注射器內，收集器表面平鋪錫箔紙用來承載PCL薄膜。調整靜電紡絲機參數：噴頭施加高電壓 (15 kV)，收集器施加低電壓 (-7.5 kV)，體積流率 1.5 mL/h，收集器轉速 2 800 r/min。靜電紡絲結束后，取下PCL薄膜，通風櫥內放置24 h去除殘留的六氟異丙醇，使用直徑1.5 mm的克氏針將PCL薄膜卷成神經導管，裁剪為1.2 mm長，鈷-60消毒后備用。為了驗證該PCL導管的取向性，我們將PCL薄膜消毒后縫在蓋玻片上，在薄膜上種植PKH26-ASCs，培養3 d后在熒光顯微鏡下觀察PKH26-ASCs的遷移情況并拍照。

9 動物分組及實驗方法 24 只體質量 200 ~ 250 g的雌性SD大鼠用于構建大鼠坐骨神經1.0 cm缺損動物模型(成年大鼠坐骨神經主干長度約2 cm，截取中間段1 cm)。使用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)對大鼠進行腹腔麻醉，暴露坐骨神經后截斷1 cm坐骨神經，根據干預措施不同，將其隨機分為4組(n=6)：1)空導管組，用單純的PCL導管橋接坐骨神經缺損后向導管內注射ASCs培養基；2)2D細胞組，PCL導管橋接坐骨神經缺損后向導管內注射 5×1052D ASCs；3)微組織組，PCL 導管橋接坐骨神經缺損后向導管內注射50個微組織；4)自體神經移植組，截斷神經后反向縫合。所有神經導管縫合后用纖維蛋白凝膠封閉間隙。麻醉蘇醒后將實驗動物置于自動供應食物水、12 h光照/黑暗循環的恒溫條件下。

10 再生神經早期的組織學評價 術后 4 周向各組大鼠腹腔注射過量的3%戊巴比妥鈉處死大鼠，完整分離出神經移植物后進行多聚甲醛固定、蔗糖脫水，行9 μm縱行冰凍切片。樣本PBS清洗3遍，10%山羊血清封閉非特異性抗原2 h，使用兔來源S100單克隆抗體和小鼠來源NF200單克隆抗體在4℃下孵育過夜。第2天PBS清洗后使用山羊抗兔 IgG/Alexa Fluor?594和山羊抗小鼠IgG/Alexa Fluor?488 在室溫下孵育 2 h。隨后 PBS清洗，DAPI工作液孵育5 min。使用熒光顯微鏡對神經移植物縱行切片進行拍照，觀察神經再生長度，使用Image-Pro Plus測量并進行統計分析。

11 統計學方法 采用 GraphPad Prism 8 進行統計學分析。所有數據均以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 ASCs的鑒定 流式細胞術結果表明，在 P3 代的ASCs中，間充質干細胞表面標記性抗原CD73(78.17%)、CD90(99.96%)、CD105(88.75%)陽性率極高，造血干細胞表面標記性抗原CD34(0.07%)、CD45(1.40%)陽性率極低(圖1)。說明我們成功在大鼠脂肪組織中提取出間充質干細胞。

圖1 ASCs的鑒定。P3代ASCs間充質干細胞表面標記性抗原CD73(A)、CD90(B)、CD105(C)陽性率及造血干細胞表面標記性抗原 CD34(D)、CD45(E)陽性率Fig.1 Identification of ASCs.The positive rates of mesenchymal stem cell surface marker antigens CD73 (A), CD90 (B)and CD105 (C) and hematopoietic stem cell surface marker antigens CD34 (D) and CD45 (E) in P3 generation ASCs

2 兩種微組織構建方法的探索及微組織形態變化的觀察 我們分別使用低黏附細胞培養板法(圖2A)和懸浮液滴法(圖2B)構建微組織。經過3 d的培養，兩種方法均成功構建了微組織。與低黏附細胞培養板法(圖2C)相比，懸浮滴法構建的微組織結構松散(圖2D)。故我們選擇低黏附細胞培養板構建微組織用于后續實驗。在探究細胞數量與微組織大小之間關系的實驗中，我們發現微組織的直徑與細胞數量呈正相關，且隨著培養時間延長，微組織呈現“壓實”的狀態，直徑逐漸變小(圖3)。

圖2 微組織的兩種構建方法 A，B：使用低黏附細胞培養板構建的微組織；C，D：通過懸浮液滴法構建的微組織Fig.2 Two construction methods of microtissue A, B: microtissue constructed using low-adhesion cell culture plate; C, D: microtissue constructed by hanging-drop method

圖3 微組織形態的7 d動態觀察。微組織的直徑與細胞數量呈正相關，且隨著培養時間延長，微組織呈現“壓實”的狀態，直徑逐漸變小Fig.3 Dynamic observation of microtissue for 7 days.The diameter of microtissue was positively correlated with the number of cells, and with the extension of culture time, the microtissue showed a 'compacted' state, and the diameter gradually decreased

3 微組織對 DRG 軸突生長的促進作用 免疫熒光染色結果顯示軸突呈綠色熒光，DRG遷移出的施萬細胞呈紅色熒光，細胞核呈藍色熒光(圖4A)。微 組 織 組 的 軸 突 長 度 (1 209.00±58.93) μm 明顯長于 2D 組的 (930.00±74.87) μm 和對照組的(730.10±71.46) μm，2D 組軸突長度也明顯長于對照組(P＜0.05)(圖4B)。PKH26標記的ASCs構建成微組織與DRG進行直接接觸的共培養7 d后，免疫熒光染色結果顯示PKH26-ASCs呈紅色熒光，DRG軸突呈綠色熒光，細胞核呈藍色熒光。在一個視野中我們發現了一個有趣的現象，DRG發出的軸突與附近的微組織緊密相連(圖4C)。

圖4 微組織與DRG的共培養 A：間接共培養后DRG的免疫熒光染色(藍色為細胞核，綠色為軸突，紅色為髓鞘)；B：間接共培養后各組DRG軸突長度(aP＜0.05)；C：微組織與DRG直接共培養后的免疫熒光染色(藍色為細胞核，綠色為軸突，紅色為PKH26染色的微組織)Fig.4 Co-culture of microtissue and DRG A: immunofluorescence staining of DRG after indirect co-culture (blue for nucleus, green for axon and red for myelin); B: the length of DRG axons in each group after indirect co-culture(aP＜0.05); C: immunofluorescence staining after direct coculture of microtissue and DRG (blue for nucleus, green for axons, and red for PKH26 stained microtissue)

4 PCL 導 管 取向性 的 驗證 我 們將 PCL 薄 膜縫合在蓋玻片上，置于六孔板中(圖5A)。將PKH26-ASCs接種于薄膜上，培養3 d后使用熒光顯微鏡進行觀察，結果顯示紅色熒光的ASCs在PCL薄膜上取向性排列(圖5B，圖5C)。

圖5 PCL導管取向性的驗證Fig.5 Verification of orientation of PCL conduit

5 微組織修復周圍神經缺損的早期評價 移植術后4周，取下神經移植物進行組織學評價(圖6B)。免疫熒光結果顯示軸突呈綠色熒光，施萬細胞呈紅色熒光，細胞核呈藍色熒光。自體神經移植組神經再生效果最佳，神經移植物中充滿了再生軸突，微組織組軸突生長明顯優于2D組和空導管組(圖6A)。微組織組(88.50%±5.80%)的軸突長度比值(軸突長度/移植物長度)明顯優于2D組(70.00%±6.58%)和空導管組(50.00%±7.35%)，且與自體神經移植組(100%)差異無統計學意義(圖6C)。

圖6 神經移植物早期的組織學評價A：各組神經移植物的免疫熒光染色(綠色為軸突，紅色為髓鞘，藍色為細胞核)；B：術后4周神經移植物大體觀(微組織組)；C：各組軸突長度比值(軸突長度/移植物長度)(aP＜0.05)Fig.6 Early histological evaluation of nerve grafts A: immunofluorescence staining of nerve grafts in each group (green for axon, red for myelin sheath and blue for nucleus); B: general view of nerve graft at 4 weeks after transplantation (microtissue group); C: ratio of axon length in each group (axon length/graft length) (aP＜0.05)

討 論

組織工程微組織策略在很多領域都得到了應用和發展。在軟骨組織工程領域，Yin等[14,24]制備了一種新型軟骨細胞微載體，該微載體負載骨髓間充質干細胞 (bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)或ASCs在旋轉細胞培養系統中動態培養生成軟骨微組織，利用該微組織進行動物關節軟骨的體內修復，取得了良好的修復效果。在骨組織工程領域，Totaro等[25]使用聚己內酯-羥基磷灰石微支架負載人間充質干細胞，經旋轉瓶動態培養后構建了骨微組織。相比于傳統的2D培養，微組織內的人間充質干細胞具有更強的成骨分化能力。在腫瘤學的研究中，Pradhan等[23]將腫瘤細胞封裝于聚乙二醇-纖維蛋白原水凝膠微球內并進行三維培養，相比于2D培養的細胞，微球內的腫瘤細胞結構明顯缺失、細胞核呈現異型性、細胞排列更加混亂、核質比與核體積增加、細胞間連接變短，證實了經微球培養的腫瘤細胞惡性程度更高。同樣的，微組織策略在心肌組織工程[21]、脂肪組織工程[17]、血管組織工程[22]領域也均成功得到了應用。但在神經組織工程領域，微組織策略的研究很少，所以我們嘗試使用微組織替代傳統2D培養的細胞進行周圍神經損傷修復的研究。

種子細胞是組織工程微組織的重要組成部分。間充質干細胞可通過誘導分泌各種神經營養因子促進神經再生，是神經組織工程中很有前途的種子細胞[26-27]。雖然BMSCs已經被廣泛應用于包括周圍神經在內的各種組織的損傷修復，但由于提取過程中提取率低且具有侵襲性，嚴重限制了其應用[28]。與BMSCs相比，ASCs在提取過程中侵襲性更低、獲得率更高、體外增殖速度更快，是組織工程良好的種子細胞[29]。所以在本研究中，我們使用ASCs構建微組織。成功提取ASCs后，我們對ASCs進行表面抗原鑒定，流式細胞術結果顯示ASCs陽性表達間充質干細胞表面標志物CD73、CD90、CD105，陰性表達造血干細胞表面標志物CD34、CD45，符合ASCs特征(圖1)。

目前，微組織的構建主要有四種方法，即懸滴細胞培養、球狀體細胞培養、微載體(或微支架)細胞培養以及微凝膠(或微球)細胞培養。前兩種微組織是通過細胞在微重力或低黏附細胞培養材料條件下自聚集形成的，后兩種微組織是用微載體或微凝膠負載細胞形成的。在我們的研究中，為了探索微組織與DRG在體外的直接相互作用，我們選擇了懸浮液滴法和低黏附細胞培養板法構建微組織。但我們發現懸浮液滴法構建的微組織結構松散，且隨培養時間的延長容易發生崩解，因此我們選擇了低黏附細胞培養板法構建微組織進行后續實驗(圖2)。為了驗證細胞數量與微組織直徑的關系，我們采用三種細胞濃度(0.5×104/70 μL、0.75×104/70 μL、1×104/70 μL)構建微組織，在連續7 d的動態觀察后，我們發現微組織的直徑與細胞數量呈正相關，且隨著培養時間的延長，微組織呈現“壓實”的狀態，其直徑不斷縮短(圖3)，這與Colle等[30]的研究結果一致。

在微組織與DRG間接共培養實驗中，Transwell培養板的聚酯薄膜可阻止上下層細胞的接觸，但允許細胞因子進行交換。實驗結果表明，微組織組的軸突顯著長于2D組(圖4A，圖4B)，說明相比于相同細胞數量2D培養的細胞，微組織可以分泌更多的神經相關營養因子促進軸突生長。但本研究的局限性也在于此，并未對具體的細胞因子進行探索，在后續的實驗中我們計劃通過PCR、ELISA等技術明確相關細胞因子。在微組織與DRG直接共培養實驗中我們發現了一個有趣的現象，DRG的軸突向著微組織方向生長(圖4C)，說明微組織對DRG軸突生長的促進作用不僅源于旁分泌作用，兩者之間可能還存在直接的相互作用，需要我們進一步探索。動物實驗中，移植術后4周我們對神經移植物進行組織學評價，結果表明微組織組的神經再生情況明顯優于2D組，進一步驗證了微組織對神經再生的有效性 (圖6)。

綜上所述，本研究在體外成功構建了微組織，并發現微組織直徑與細胞數量和培養時間之間的相互關系，隨后將微組織與DRG進行直接共培養和間接共培養，發現微組織可以促進軸突生長，并且在實驗中發現微組織與DRG軸突之間存在直接相互作用。隨后在體內實驗中，進一步驗證微組織對大鼠坐骨神經缺損的修復效果，結果表明微組織可以促進神經再生。但本研究仍然存在很多缺陷和不足：1)在微組織與DRG間接共培養中，并未對其原因進行探索，如究竟是哪種細胞因子促進了軸突再生；2)在神經組織工程研究中，通常有兩種重要的工具細胞，除DRG之外還有施萬細胞，微組織是否可以促進施萬細胞增殖需進一步探索；3)微組織與DRG軸突之間存在相互作用，這對干細胞治療的轉歸問題有所啟示，其機制需要我們繼續探究；4)微組織與施萬細胞之間是否同樣存在相互作用；5)微組織對坐骨神經缺損的早期修復具有良好的效果，如果將修復時間延長，修復效果是進一步增強還是減弱甚至無效，需要后續實驗驗證。

致謝：感謝解放軍總醫院骨科研究所所有工作人員的技術指導和幫助。

利益沖突聲明：作者聲明本文無任何利益沖突。