大麻二酚對衰老小鼠骨髓間充質干細胞成骨分化影響的體外細胞實驗

李 琳，朱 彪，田蕭羽，黨瑞杰，趙立升，楊 爍，孫 磊，溫 寧解放軍醫學院，北京 0085； 首都醫科大學附屬復興醫院 口腔科，北京 0008； 解放軍總醫院第一醫學中心 口腔科，北京 0085； 中國人民解放軍戰略支援部隊特色醫學中心 口腔科，北京000

老年性骨質疏松是老年人常見的代謝性骨疾病，其造成骨質量下降，增加骨折風險并導致骨折愈合延遲，嚴重影響老年人生活質量[1]。正常生理狀態下，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的自我更新和成骨分化是維持骨組織穩態及骨折修復的重要機制[2]。BMSCs與成骨細胞譜系間復雜的相互作用會受到年齡的影響[3]。研究表明衰老BMSCs的成骨分化能力逐漸降低，不利于骨組織的正常代謝和損傷重建[4]。因此，使用藥物改善年齡相關的骨質疏松對維持骨代謝平衡具有重要意義。大麻二酚(cannabidiol，CBD)是一種具有廣泛生物學活性的大麻素類天然化合物[5]。體外實驗發現，CBD可促進干細胞向成牙及成骨方向分化[6]。同時，CBD的干預可誘導細胞自噬，并決定了間充質干細胞在應激條件下的命運[7]。自噬過程對BMSCs成骨分化至關重要[8]，但CBD能否促進衰老狀態下BMSCs的成骨分化仍不清楚。因此，本研究利用D-半乳糖(D-galactose，D-gal)作用于小鼠BMSCs建立體外細胞衰老模型，研究CBD對衰老BMSCs成骨分化的影響，并探討自噬在其中的作用，為CBD的臨床應用提供實驗證據。

材料與方法

1 細胞、試劑與儀器 5 周齡 C57BL/6 小鼠BMSCs(解放軍總醫院轉化醫學中心實驗室)；CBD(CATO，美國)；D-gal(索萊寶，中國)；氯喹(chloroquine，CQ；Sigma，美國)；胰酶(Sigma，美國)；胎牛血清、α-MEM培養基(Gibco，美國)；PBS(Hyclone，美國)；成骨誘導液(賽業，中國)；CD11b、CD29、CD44、CD45、CD31、CD34、CD73、CD90、CD105抗體(BD，美國)；CCK-8試劑盒、RIPA、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒(碧云天，中國)；P62抗體(#5114；CST，美國)；LC-3B 抗體(Ab192890；Abcam，英國)；β-actin 抗體(BM0627；博士德，中國)；BCA蛋白定量試劑盒(博士德，中國)；qRT-PCR試劑盒(Takara，日本)；細胞培養箱、酶標儀(Thermo，美國)；流式細胞儀(BD Celesta，美國)；蛋白電轉、電泳設備(Bio-Rad，美國)；實時熒光定量PCR儀(FTC-3000P，Funglyn Biotech，加拿大)。

2 BMSCs的培養 復蘇凍存的 5 周齡 C57BL/6小鼠BMSCs，接種于含有10%胎牛血清的α-MEM培養基，置于含5% CO2的37℃細胞培養箱中培養，細胞貼壁生長至80% ~ 90%時傳代，并使用第 3 ~ 5 代細胞進行實驗。

3 流式細胞術鑒定 BMSCs 第 3 代細胞正常培養2 d后，在培養皿中加入適量0.25%胰酶，終止消化后 l 000 r/min 離心 5 min 收集細胞。PBS 洗滌細胞3次后分別加入帶有熒光標記的BMSCs表面標志物的抗體(CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105)。輕彈混勻后放置于冰上避光孵育30 min，PBS洗滌2次后重懸細胞，上機檢測干細胞表面標志物的表達情況。采用FlowJo 10.4軟件進行數據分析。

4 CCK-8 法檢測細胞增殖 將第 3 代 BMSCs以3×103/孔的密度接種于96孔板，細胞隨機分為對照組(Vehicle)、衰老模型組 (40 g/L D-gal[9])和CBD 干預組 (40 g/L D-gal + 2.5 μmol/L CBD)。細胞接種過夜后更換為含有 40 g/L D-gal或 40 g/L D-gal + 2.5 μmol/L CBD 干預的培養基，連續培養，每 2 ~ 3 d 換液，于接種后 1 ~ 10 d 每天檢測細胞的增殖活力。測定時，按照CCK-8說明書，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液并于 37℃ 孵育 2 h 后，使用酶標儀測量其在450 nm波長處的吸光度值。

5 Western blot檢測 LC-3B 及 P62 蛋白表達 將第3代BMSCs以5×104/孔的密度接種于6孔板，細胞隨機分為對照組(Vehicle)、衰老模型組(40 g/L D-gal)、CBD 干 預 組 (40 g/L D-gal + 2.5 μmol/LCBD)和自噬抑制組 (40 g/L D-gal + 2.5 μmol/L CBD + 20 μmol/L CQ[10])。細胞接種過夜后加藥并加入成骨分化誘導液，成骨誘導培養7 d后用RIPA裂解液提取細胞蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后定量30 μg蛋白上樣并進行電泳及轉膜，按照1∶1 000的濃度配置一抗P62和LC-3B并進行孵育，4℃過夜，次日二抗室溫孵育1 h后使用顯影劑觀察條帶上蛋白的表達情況。具體實驗步驟參照文獻[11]。

6 qRT-PCR 檢測衰老及成骨相關基因的 mRNA表達 將第3代BMSCs以1×105/孔的密度接種于6孔板，細胞隨機分為對照組(Vehicle)、衰老組(D-gal)和 CBD 干預組 (D-gal + CBD)，正常培養3 d后使用TRIzol試劑提取總RNA，測定RNA濃度后定量1 μg RNA為模板，反轉錄為cDNA，使用實時熒光定量PCR儀檢測衰老相關基因P16和P21的mRNA表達；將BMSCs以5×104/孔的密度接種于6孔板，細胞分組及處理同Western blot，然后使用qRT-PCR檢測成骨相關基因ALP、Runt相關轉錄因子 2(runt-related transcription factor 2，Runx2)和骨鈣素(osteocalcin，OCN)的轉錄表達。PCR 反應條件：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃15 s，72℃ 15 s，40 個循環。相關引物均由上海生工合成，引物序列見表1。

表1 衰老及成骨相關基因引物序列Tab.1 Primers sequences used for qRT-PCR

7 ALP 活性檢測 將 BMSCs 以 5×104/孔的密度接種于6孔板，細胞分組及處理同Western blot。分別于加藥后 1 d、3 d、5 d 和 7 d 按照 ALP 檢測試劑盒的操作說明收集各組細胞裂解液，分別取50 μL 加入 96 孔板，37℃ 孵育 5 min 后加入 100 μL終止液終止反應，測量樣品在405 nm波長處的吸光度值并計算各組的ALP活性。

8 統計學分析 使用 SPSS26.0 和 Graphpad Prism 9.0進行數據分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 小鼠 BMSCs 鑒定及體外衰老模型的建立 對復蘇的小鼠BMSCs進行表面標志物鑒定，流式細胞術結果顯示，P3代小鼠BMSCs高表達間充質干細胞表面標志CD29(99.27%)、CD44(98.04%)、CD73(96.66%)、CD90(99.26%)和 CD105(98.90%)，低表達造血及內皮細胞表面標志CD11b(1.11%)、CD31(0)、CD34(1.35%)和 CD45(0.98%)(圖1A)。使用40 g/L D-gal作用于 BMSCs，qRT-PCR顯示 D-gal處理后BMSCs的P16和P21 mRNA表達水平顯著升高(P＜0.05)，證明D-gal處理成功建立了衰老BMSCs模型；而CBD干預后P16和P21的表達水平較D-gal組明顯降低(P＜0.05)，提示CBD可明顯改善D-gal誘導的細胞衰老狀態(圖1B)。

圖1 小鼠BMSCs衰老細胞模型的建立A：小鼠BMSCs表面標志物鑒定；B：P16和P21的mRNA表達水平(aP＜0.05，vs Vehicle組；bP＜0.05，vs D-gal組)Fig.1 Senescence model of mice BMSCs A: surface markers of mice BMSCs by flow cytometric analysis; B: mRNA expression levels of P16 and P21 (aP＜0.05, vs vehicle group; bP＜0.05, vs D-gal group)

2 CBD 促進衰老 BMSCs的增殖活性 CCK-8 法檢測 D-gal及 CBD 處理后小鼠 BMSCs 1 ~ 10 d 的增殖變化。與正常增殖的空白對照組相比，D-gal誘導的衰老BMSCs從第4天開始增殖活力明顯降低(P＜0.05)，而聯用CBD則顯著增強，從第5天開始與僅使用D-gal組有統計學差異(P＜0.05)，表明CBD可促進衰老BMSCs的增殖。見圖2。

圖2 CBD對衰老BMSCs增殖的影響(aP＜0.05，vs Vehicle組；bP＜0.05，vs D-gal組)Fig.2 Effect of CBD on senescent BMSCs proliferation (aP＜0.05,vs vehicle group; bP＜0.05, vs D-gal group)

3 CBD 激活衰老 BMSCs 中自噬相關蛋白的表達Western blot檢 測 各 組BMSCs 中 自 噬 相關P62和LC3B蛋白表達情況。在D-gal誘導的衰老模型中，P62蛋白表達顯著升高，LC3B-Ⅱ表達降低(P＜0.05)。而CBD干預顯著提高了被D-gal抑制的LC3B-Ⅱ表達，同時降低P62蛋白表達(P＜0.05)，提示CBD可激活BMSCs的自噬活性。而在CBD干預組中再加入自噬抑制劑氯喹后，P62蛋白和LC3B-Ⅱ蛋白的表達均升高(P＜0.05)，表明自噬抑制劑氯喹抑制了CBD激活的BMSCs自噬。見圖3。

圖3 CBD對衰老BMSCs中自噬相關蛋白P62和LC3B表達的影響(aP＜0.05，vs Vehicle組；bP＜0.05，vs D-gal組；cP＜0.05，vs D-gal+CBD 組)Fig.3 Effect of CBD on protein levels of P62 and LC3B in senescent BMSCs (aP＜0.05, vs vehicle group; bP＜0.05, vs D-gal group; cP＜0.05, vs D-gal+CBD group)

4 CBD 通過自噬增強衰老 BMSCs成骨相關基因的表達 qRT-PCR檢測成骨相關基因的mRNA表達。與空白對照組相比，D-gal組中ALP、Runx2和OCN基因mRNA表達水平均顯著降低(P＜0.05)，提示衰老BMSCs中成骨分化受到抑制。而CBD干預組ALP、Runx2和OCN的mRNA表達水平顯著高于D-gal組(P＜0.05)，同時高于空白對照組(P＜0.05)。而當CBD激活的自噬被氯喹抑制后，CBD提高成骨相關基因mRNA表達水平的作用被顯著抵消，表明CBD增強衰老BMSC成骨分化的作用在一定程度上是由激活自噬產生的。見圖4。

圖4 CBD對成骨相關基因轉錄表達的影響(aP＜0.05，vs Vehicle組；bP＜0.05，vs D-gal組；cP＜0.05，vs D-gal+CBD組)Fig.4 Effect of CBD on mRNA expression levels of osteogenesisrelated gene (aP＜0.05, vs vehicle group; bP＜0.05, vs D-gal group; cP＜0.05, vs D-gal+CBD group)

5 CBD 通過自噬增強衰老 BMSCs 的 ALP 活性 經成骨誘導培養后，各組BMSCs隨著時間生長，ALP活性逐漸增強。與空白對照組相比，D-gal誘導的衰老BMSCs組ALP活性受到顯著抑制(P＜0.05)，而在 3 d、5 d 和 7 d 時，CBD 干預組BMSCs的ALP活性較衰老組顯著增強(P＜0.05)。但當CBD與自噬抑制劑氯喹聯用時，ALP活性顯著降低(P＜0.05)。以上結果說明CBD增強衰老BMSCs的ALP活性的作用，與激活自噬明顯相關。見表2。

表2 各組BMSCs的ALP活性檢測Tab.2 ALP activity of different groups

討 論

本研究通過使用D-gal構建衰老BMSCs模型，在衰老BMSCs中觀察到CBD能夠降低衰老相關基因P16、P21的表達水平，促進衰老BMSCs增殖，激活自噬相關蛋白，并促進成骨相關基因的表達，提高衰老BMSCs的ALP活性。加入自噬抑制劑氯喹后，CBD促進衰老BMSCs成骨分化的作用明顯減弱，表明CBD通過激活自噬促進衰老BMSCs的成骨分化。

間充質干細胞具有多能性，其自我更新和成骨譜系分化是維持骨組織穩態和修復的重要基礎[12]。在生理性過程中，BMSCs在細胞因子的激活下增殖并分化為成骨細胞和軟骨細胞等，通過分泌細胞外基質維持骨代謝平衡[13]。在本研究中，我們首先通過流式細胞術對培養的小鼠BMSCs進行鑒定，發現其高表達間充質干細胞表面分子，證明我們成功培養了骨髓間充質干細胞。

P16和P21是細胞周期的負性調節蛋白，作為衰老標志物，是氧化應激等多重因素引發細胞衰老的重要機制[14]。研究表明CBD可降低衰老胰島細胞中P16和P21的表達[15]。在本研究中，D-gal顯著提高了BMSCs的P16和P21的mRNA表達水平，表明D-gal的干預成功誘導了BMSCs的衰老狀態。而CBD的加入顯著降低了D-gal引起的P16和P21表達升高，提示CBD在抵抗BMSCs衰老中的有益作用。

干細胞的增殖潛能往往會隨著衰老的進程而逐漸減弱，并與骨質疏松的發生密切相關[16]。研究發現，老年小鼠BMSCs的增殖能力顯著降低[17]。體外實驗表明，CBD單獨應用可促進BMSCs的活力[18]。在本實驗中我們也觀察到，經D-gal處理后的BMSCs，增殖活性受到明顯抑制，而聯用CBD則顯著恢復了增殖活性，表明CBD可在一定程度上促進衰老BMSCs的增殖潛能。

自噬是細胞代謝的重要過程，能夠通過溶酶體清除胞內異常物質而維持細胞穩態，且與細胞衰老關系密切[19-20]。研究發現，代表細胞衰老狀態的P16和P53水平與細胞自噬水平呈明顯正相關[21]。P62是細胞自噬的底物蛋白，與自噬的激活狀態呈負相關[22]。當自噬激活時P62被利用，當自噬被抑制時P62蛋白在細胞內堆積[23]。LC3B是自噬的標志蛋白，當自噬激活時，胞質游離型LC3B-Ⅰ迅速轉換為膜結合型LC3B-Ⅱ，進而促進自噬體的形成[24]。在本研究中，衰老BMSCs的P62蛋白表達升高，LC3B-Ⅱ水平較低，說明其自噬狀態受到抑制。CBD干預降低P62表達水平，同時升高LC3B-Ⅱ表達水平，表明CBD能夠激活自噬過程。氯喹是自噬過程的抑制劑，通過抑制自噬體與溶酶體的融合在自噬晚期發揮抑制作用[25]。因此氯喹干預后LC3B-Ⅱ的表達水平并不會降低。我們將CBD與氯喹聯用，發現P62與LC3B-Ⅱ的表達顯著增高，表明CBD激活的自噬被氯喹抑制，從反面證明了CBD對自噬的激活作用。

成骨分化能力下降是衰老BMSCs最重要的表現，與自噬抑制顯著相關[26]。但CBD是否能通過自噬過程調控BMSCs成骨分化尚無實驗證據。ALP和Runx2是BMSCs成骨分化早期的重要指標，而OCN主要表達于成骨后期[27]。研究表明在MG-63細胞中，CBD促進ALP和Runx2的表達并提高ALP活性[7]。我們首先通過qRT-PCR檢測了BMSCs中ALP、Runx2和OCN的mRNA表達情況，結果顯示經D-gal干預的BMSCs中三種基因的mRNA表達均降低，而聯用CBD抵消了D-gal對成骨基因表達的抑制作用。同時，我們觀察到ALP活性檢測結果與qRT-PCR結果一致，CBD顯著提高了被D-gal降低的BMSCs的ALP活性。可以推斷，CBD可能在成骨的早期和后期具有持續的促進衰老BMSCs成骨分化的作用，而自噬抑制劑氯喹可部分對抗CBD促進成骨相關基因表達和提高ALP活性的效應。以上結果表明，CBD通過激活自噬進而促進D-gal誘導的衰老BMSCs成骨分化。

有研究發現，ROS水平升高、氧化應激和自由基損傷等是細胞衰老的重要機制[28]。而D-gal通過誘導細胞氧化應激損傷，包括ROS的升高，從而建立體外細胞衰老模型[29]。既往研究表明，CBD能夠降低衰老胰島細胞內的氧化應激應答和ROS水平[15]，因此衰老小鼠BMSCs中CBD促進成骨分化與細胞內氧化應激及ROS水平的關系值得進一步探討。本研究存在一定的局限性，CBD對衰老小鼠骨質疏松的干預效果仍需體內實驗的數據。

綜上所述，CBD的干預可激活衰老小鼠BMSCs的自噬過程，這種激活作用能夠促進衰老小鼠BMSCs成骨分化。CBD作為一種安全有效的藥物，對衰老性骨質疏松的治療潛力值得關注。