骨改建中miR-134-5p通過靶向Itgb1抑制小鼠破骨細胞形成的研究

黃 萌，江小霞，崔建通，趙長銘，王振寧，張 宇，吳麗麗，孫兆峰，徐璐璐 解放軍總醫院研究生院，北京 0085； 解放軍總醫院第一醫學中心 口腔正畸科，北京 0085； 軍事科學院軍事醫學研究院軍事認知與腦科學研究所，北京 0009

骨改建是維持骨骼正常結構的重要過程。在骨微環境中，破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞的骨生成相互平衡，共同維持骨的基本結構穩定。而外傷、激素水平等因素的刺激會引起骨改建微環境的變化，可能會導致破骨細胞異常激活，從而導致骨組織出現不必要的吸收、溶解，影響骨結構的穩態[1]。因此，探究骨改建時影響破骨細胞的因素及其機制尤為重要。微RNA(microRNA，miRNA)作為轉錄后基因表達的調控因子，是一種長度約 22 nt的內源性非編碼RNA[2]。研究表明多種miRNA在破骨細胞生成過程中起著不可忽視的作用[3-4]。它們通過調控靶基因從而改變骨穩態，使骨微環境向骨形成或骨吸收方向進展[5-7]。在大鼠平滑肌中miR-134-5p過表達可以促進鈣沉積，而這也是成骨作用開始發生的表現[8]。然而，miR-134-5p對骨吸收調控的相關機制尚未見報道。因此本研究旨在探討miR-134-5p在破骨細胞分化中發揮的作用及其可能的機制，進一步闡明miR-134-5p在骨改建過程中的作用機制。

材料與方法

1 實驗動物 6 ~ 8 周齡 SPF 級 C57BL/6 雄性小鼠購于斯貝福(北京)生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2019-0010。動物實驗經軍事科學院軍事醫學研究院倫理委員會審核并予以批準(IACUC-DWZX-2020-729)。

2 主要試劑和材料 α-MEM 培養基 (Gibco，美國)；特級胎牛血清FBS(Gibco，美國)；磷酸緩沖鹽溶液PBS(Gibco，美國)；青霉素/鏈霉素雙抗(Gibco，美國)；核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor κ B ligand，RANKL)、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF；Peprotech，美國)；轉染試劑 LipofectamineTM2000 試劑盒 (Invitrogen，美國)；mRNA引物、miR-134-5p引物、miR-134-5p 過表達模擬物 miR-134-5p agomir、敲低模擬物miR-134-5p antagomir及相應陰性對照(agomir NC 和 antagomir NC；生工生物工程股份有限公司，中國)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartaric acidic phosphatase，TRAP) 試劑盒 (Sigma aldrich，美國)；Trizol(Invitrogen，美國)；SYBR Green 熒光定量 PCR 檢測試劑盒、PrimeScript RT reagent kit反轉錄試劑盒(Takara，日本)；4%多聚甲醛、0.1% Triton X-100 鬼筆環肽、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；上海碧云天)；RIPA緩沖液(Sigma，美國)；BCA 試 劑 盒 (Thermo Fisher Scientific，USA)；兔抗鼠GAPDH 、兔抗鼠TRAP抗體、兔抗鼠CTSK、兔抗鼠NFATc1和兔抗鼠Itgb1抗體(Affinity Biosciences，USA)；羊抗兔二抗 (中杉金橋)；ECL發光液(普利萊)。

3 小鼠骨髓來源巨噬細胞的分離和培養 6 ~ 8周齡的C57BL/6雄性小鼠采用頸椎脫臼法處死，浸沒于75%乙醇中。在無菌條件下分離小鼠下肢皮膚，暴露脛骨、股骨，剔除肌肉、筋膜等軟組織，用含雙抗的PBS沖洗股骨和脛骨，隨后剪去干骺端，使用1 mL無菌注射器吸取無血清α-MEM培養基反復沖洗骨髓腔，直至骨髓腔內無血塊為止。將含有骨髓細胞的無血清α-MEM培養基轉移至15 mL離心管中，移液器將細胞吹打混勻，1 000 r/min 離心 5 min 后棄去上清，用含 10%FBS的α-MEM完全培養基重懸細胞，接種于T25培養瓶中，在溫度為37℃、5% CO2培養箱中培養 6 ~ 8 h。收集培養瓶中未貼壁的細胞，即為小鼠骨髓來源的巨噬細胞 (bone marrow monocytes，BMMs)。1 000 r/min 離心 5 min 后棄去上清，用含10% FBS的α-MEM完全培養基重懸細胞，計數，然后進行后續相關實驗。

4 骨髓來源巨噬細胞的誘導分化 將 BMMs 以5×105/孔接種于 24 孔板中，用含 30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL的α-MEM完全培養基培養，每2 d換液，誘導7 d后進行相應檢測。將提取的原代BMMs以1×104/孔接種于96孔板中，細胞誘導至7 d時，根據TRAP染色試劑盒說明書對誘導的細胞進行TRAP染色：移除培養液，用PBS洗3遍，每次5 min。4% 多聚甲醛固定 20 min，PBS洗3遍，每次 5 min，使用TRAP染色液37℃孵育1 h后終止染色，在倒置相差顯微鏡下觀察并拍照，記錄每個孔中TRAP陽性且細胞核數目≥3的破骨細胞數目。

5 細胞分組及轉染 實驗分為過表達 miR-134-5p(agomir)組、敲低 miR-134-5p (antagomir)組及其 相應對照組 (agomir NC 和 antagomir NC)。 將BMMs細胞以1×106/孔種于12孔板中，按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書，使用LipofectamineTM2000 將 agomir、antagomir及其相應對照 agomir NC、antagomir NC 分別轉染入 BMMs中，在37℃、5% CO2培養箱中培養24 h后更換含 30 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL 的 α-MEM培養基繼續誘導培養7 d。按照TRAP染色試劑盒說明書對細胞進行TRAP染色(方法同前)，檢測轉染后各組形成的破骨細胞數目。

6 肌動蛋白環 (F-actin)染色 為檢測誘導后形成的破骨細胞中肌動蛋白環數目，將提取的原代BMMs以1×104/孔接種于96孔板中，細胞按照分組誘導至7 d時，PBS清洗BMMs誘導的破骨細胞3次，4%多聚甲醛冰上固定15 min，PBS清洗細胞3次；用含0.5% Triton X-100的PBS室溫透化細胞10 min，PBS清洗細胞3次；加入鬼筆環肽染色液，在室溫避光孵育20 min，進行染色；PBS清洗細胞3次，加入DAPI染色液復染10 min，吸去染色液，PBS 清洗細胞3次；吸去多余水分，封片，熒光顯微鏡觀察纖維狀肌動蛋白(F-actin)。經標記后細胞呈紅色空泡狀，含有3個或3個以上DAPI藍染細胞核的陽性細胞即為破骨細胞。

7 RNA 提取及 qRT-PCR 使用 Trizol提取細胞中的總RNA，按照mRNA和miRNA反轉錄試劑盒說明書，分別對總RNA進行反轉錄合成cDNA，采用SYBR Green熒光定量PCR檢測試劑盒或miRNA熒光定量PCR試劑盒進行檢測。實時定量PCR以β-actin為內參，檢測破骨相關因子的表達；以U6作為內參，用miRNA熒光定量PCR試劑盒檢測miR-134-5p的相對表達量，引物序列見表1，結果以2-ΔΔCt表示，實驗重復3次。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

8 預 測 miR-134-5p 靶 基 因 通 過 靶 基 因 數 據庫TargetScan(http://www.targetscan.org)、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)以及miRDB(http://mirdb.org)在線預測 miR-134-5p 的靶基因結果，繪制韋恩圖，得到交集靶基因。

9 檢測靶基因和蛋白表達量 收集誘導后的破骨細胞，分別通過qRT-PCR(實驗步驟同上文“7 RNA 提取及 qRT-PCR”)和 Western blot檢測轉染后各組Itgb1基因和蛋白表達量。

10 Western blot檢測 Western blot檢測收集轉染后的破骨細胞，用PBS清洗2遍，加入細胞裂解液RIPA裂解細胞。按照BCA試劑盒的說明，測定蛋白含量后，制備10% SDS-PAGE的凝膠取定量的總蛋白量進行電泳，PVDF轉膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉 1 h，一抗TRAP、CTSK和NFATc1按照1∶1 000的濃度配制后4℃孵育過夜；次日TBST洗3次，每次10 min，加入二抗室溫孵育1 h后，TBST洗3次，ECL發光液顯色。使用 Image J 軟件對 Western blot條帶進行分析。

11 統計與分析 采用 Graphpad Prism 7 軟件進行統計學分析。數據以3次獨立重復實驗的±s表示，兩組間樣本均數比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間樣本比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 BMMs 分離培養和誘導分化情況 小鼠 BMMs在含有 30 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL 培養基的誘導下，在7 ~ 10 d內發生細胞融合，形成多核巨細胞。通過TRAP染色方法，發現與誘導1 d的BMMs細胞相比，誘導7 d后的BMMs細胞可形成大量多核巨細胞，且兩組有統計學差異(P＜0.001；圖1)。對形成的破骨細胞進行實時定量PCR檢測，發現在破骨誘導過程中破骨相關基因TRAP、CTSK和NFATc1表達升高(圖2A~C)，而破骨細胞中miR-134-5p的表達降低(P＜0.05；圖2D)，提示破骨誘導成功，且miR-134-5p在破骨細胞中發揮抑制作用。

圖1 BMMs破骨誘導分化7 d后的TRAP染色A：破骨誘導1 d后的TRAP染色；B：破骨誘導7 d后的TRAP染色；C：對形成破骨細胞進行定量分析Fig.1 TRAP staining after the BMMs was induced for 7 days A: TRAP staining after the BMMs was induced for 1 day; B: TRAP staining after the BMMs was induced for 7 days; C: quantitative analysis of the formation of osteoclasts

圖2 BMMs破骨誘導分化7 d后的破骨相關基因TRAP (A)、CTSK (B)、NFATc1(C)及miR-134-5p (D)的表達Fig.2 Expression levels of osteoclast-related genes TRAP (A), CTSK (B), NFATc1(C) and miR-134-5p after the BMMs was induced for 7 days

2 miR-134-5p 過表達和敲低模擬物轉染效率的驗證 BMMs轉染miR-134-5p過表達和敲低模擬物及其相應陰性對照48 h后，通過qRT-PCR檢測其轉染效率。與各自陰性對照組相比，miR-134-5p過表達組(轉染agomir組)破骨細胞中miR-134-5p表達顯著升高(P＜0.001)，而在miR-134-5p敲低組(轉染antagomir組)顯著降低(P＜0.05；圖3)，表明細胞成功實現miR-134-5p過表達或敲低。

圖3 miR-134-5p過表達物agomir、敲低物antagomir及其相應對照的轉染效率 A：轉染agomir后檢測其轉染效率；B：轉染antagomir后檢測其轉染效率Fig.3 Transfection efficiency of miR-134-5p A: transfection efficiency after agomir was transfected into the BMMs;B: transfection efficiency after antagomir was transfected into the BMMs

3 miR-134-5p 抑制破骨細胞的形成 對進行轉染的細胞進行TRAP染色對破骨細胞數目進行計量，并且進行肌動蛋白環(F-actin)染色，同時通過qRT-PCR檢測破骨相關基因。結果顯示，轉染agomir后，TRAP染色示agomir組中TRAP染色陽性的多核巨細胞數較對照組顯著減少(P＜0.01)；而轉染antagomir后，antagomir組中TRAP染色陽性的多核巨細胞數較對照組明顯增加(P＜0.01；圖4)。通過F-actin免疫熒光檢測肌動蛋白環數目，并對其進行統計分析，也顯示了同樣的結果——轉染agomir后肌動蛋白環的形成數目顯著減少，而轉染antagomir后肌動蛋白環形成數目明顯增多(P＜0.01；圖5)。同時，通過qRT-PCR檢測破骨分化相關基因TRAP、CTSK和NFATc1，轉染agomir后破骨分化相關基因的表達明顯低于對照組，相反，轉染antagomir后破骨分化相關基因表達較對照組升高(P＜0.001；圖6)。上述結果提示miR-134-5p可顯著抑制破骨細胞生成。

圖4 miR-134-5p過表達(轉染agomir)抑制破骨細胞形成，敲低(轉染antagomir)促進破骨細胞形成A：轉染agomir后進行TRAP染色觀察破骨細胞形成數目；B：轉染antagomir后進行TRAP染色觀察破骨細胞形成數目Fig.4 Overexpression level of miR-134-5p (transfected with agomir) inhibited osteoclasts formation and knockdown of miR-134-5p (transfected with antagomir) accelerated the formation of the the osteoclasts A: the number of osteoclasts was counted by TRAP staining after transfected with agomir; B: the number of osteoclasts was counted by TRAP staining after transfected with antagomir

圖5 miR-134-5p過表達(轉染agomir)抑制肌動蛋白環形成，敲低(轉染antagomir)促進肌動蛋白環形成A：轉染agomir后進行F-actin染色觀察肌動蛋白環形成數目；B：轉染antagomir后進行F-actin染色觀察肌動蛋白環形成數目Fig.5 Overexpression level of miR-134-5p (transfected with agomir) inhibited actin ring formation and knockdown of miR-134-5p (transfected with antagomir) accelerated actin ring formation A: the number of actin ring was counted by F-actin staining after transfected with agomir; B: the number of actin ring was counted by F-actin staining after transfected with antagomir

圖6 miR-134-5p過表達(轉染agomir)抑制破骨分化相關基因表達，敲低(轉染antagomir)促進破骨分化相關基因表達A：轉染agomir后進行qRT-PCR檢測破骨分化相關基因表達；B：轉染antagomir后進行qRT-PCR檢測破骨分化相關基因表達Fig.6 Overexpression level of miR-134-5p (transfected with agomir) inhibited the expression levels of the osteoclast-related genes and knockdown of miR-134-5p (transfected with antagomir) accelerated the expression levels of osteoclast-related genes A: the expression levels of osteoclast-related genes were measured by qRT-PCR after transfected with agomir; B: the expression levels of osteoclast-related genes were measured by qRT-PCR after transfected with antagomir

4 miR-134-5p 靶 基 因 預 測 為 了 進 一 步 探究miR-134-5p抑制破骨細胞分化的相關機制，通過TargetScan 、miRWalk、miRDB 這三個靶基因數據庫在線預測 miR-134-5p的靶基因，對三者所預測的結果繪制韋恩圖，得到交集靶基因。結果提示miR-134-5p與Itgb1的3’UTR區域存在結合位點，可能是miR-134-5p潛在的靶基因(圖7)。

圖7 Itgb1可能是miR-134-5p調控的靶基因A：TargetScan、miRDB及miRWalk預測的miR-134-5p交集靶基因；B：生物信息網站TargetScan預測miR-134-5p可能調控Itgb1以及調控位點區域Fig.7 Itgb1 may be the potential target gene regulated by miR-134-5p A: crosstalk of miR-134-5p target genes predicted by TargetScan, miRDB and miRWalk; B: miR-134-5p potentially targeted Itgb1 genes and its regulatory site region

5 qRT-PCR 及 Western blot檢 測 miR-134-5p 靶基因Itgb1和蛋白表達量 qRT-PCR顯示，與對照組比較，轉染agomir組中Itgb1表達顯著降低(P＜0.001)，而轉染antagomir組中Itgb1表達升高(P＜0.05；圖8)。Western blot檢測 Itgb1 蛋白的表達水平，條帶結果顯示，與對照組相比，轉染agomir后Itgb1蛋白表達量減少，轉染antagomir后Itgb1蛋白表達量增加，對Western blot條帶進行統計分析，也呈現同樣的結果(P＜0.01；圖9)。

圖8 qRT-PCR顯示過表達或敲低miR-134-5p對Itgb1基因表達的影響 A：過表達miR-134-5p后Itgb1基因表達降低；B：敲低miR-134-5p后Itgb1基因表達升高Fig.8 Expression level of Itgb1 gene was determined after overexpression or knockdown of miR-134-5p A: the expression level of Itgb1 gene decreased with overexpression level of miR-134-5p; B: the expression level of Itgb1 gene increased with knockdown of miR-134-5p

圖9 Western blot顯示過表達或敲低miR-134-5p對Itgb1蛋白表達的影響 A：過表達miR-134-5p后Itgb1蛋白表達降低；B：敲低miR-134-5p后Itgb1蛋白表達升高Fig.9 Expression level of Itgb1 protein was determined after overexpression or knockdown of miR-134-5p A: the expression level of Itgb1 protein decreased with overexpression level of miR-134-5p; B: the expression level of Itgb1 protein increased with knockdown of miR-134-5p

討 論

骨改建是生物體受外界干預后發生的復雜生理性反應，其發生的生物學基礎即骨組織的可塑性，也是人們研究的熱點和重點[9]。多種細胞參與了骨改建的過程，如成骨細胞、骨髓間充質干細胞、破骨細胞等，其中破骨細胞發揮著重要作用。破骨細胞的發生主要是通過RANK受體激活RANKL，從而引起下游NF-κB和其他信號通路的激活，增強NFATc1的表達，繼而引起包括TRAP、MMP9、Cathepsin K等破骨細胞相關基因的表達升高[10]。這一過程受到多種細胞因子和蛋白的調控，其中miRNA的作用不可忽視。miRNA是一類保守性強、內源性的非編碼小RNA，由多種酶加工合成，其通過與靶基因mRNA的3’-UTR區域結合起到識別和沉默靶基因的作用[11]。miRNA在包括增殖、代謝和疾病發生等領域都發揮著不同的作用，其中包括骨改建的過程。Guo等[12]研究發現口頜面發育過程中miR-206-3p可以促進成骨，而抑制破骨細胞分化。Liu等[13]發現在TNF-α誘導的骨丟失中miR-1247-5p發揮著重要作用。

在血管平滑肌組織中，Choe等[8]發現miR-134-5p可通過抑制組蛋白去乙酰化酶5促進血管平滑肌細胞中鈣沉積。而成骨細胞正是通過鈣沉積逐漸形成骨基質，這提示我們miR-134-5p與骨再生密切相關[8,14]。然而，miR-134-5p在骨改建過程中的作用尚未見報道。因此本研究關注于破骨分化，主要探討了miR-134-5p在破骨細胞分化過程中發揮的作用。

本研究首次發現，利用小鼠BMMs進行破骨誘導分化，miR-134-5p的表達在破骨發展過程中降低，據此我們猜想miR-134-5p在破骨過程中發揮作用。因此，我們通過在BMMs中分別轉染miR-134-5p過表達物(agomir)、miR-134-5p敲低物(antagomir)及其各自的陰性對照后進行破骨細胞誘導分化，驗證miR-134-5p在其中的具體作用。我們采用TRAP染色和F-actin染色驗證破骨細胞的形成[15]。結果顯示，與其陰性對照相比，agomir組TRAP染色陽性且細胞核數目大于3的破骨細胞數量和肌動蛋白環數目明顯減少，這說明miR-134-5p抑制了骨髓巨噬細胞向破骨細胞的形成和分化。為了進一步驗證miR-134-5p在破骨細胞分化中的抑制作用，我們檢測了破骨相關基因TRAP、CTSK和NFATc1的表達，在過表達后其均下降，而敲低后均上調，與染色結果一致。這些結果表明，miR-134-5p可以負調控破骨進程從而影響BMMs的破骨分化，這與Dinesh等[16]的結果相似。同樣，Zhang等[17]研究發現，miR-134-3p在創傷性股骨頭修復中起積極作用，可以促進骨髓間充質干細胞增殖，進而加速骨組織的修復。

接下來，我們尋找miR-134-5p可能的靶標，我們通過生物信息學方法，通過將TargetScan、miRDB和miRWalk三個數據庫中關于miR-134-5p可能調控的基因取交集，對miR-134-5p的潛在靶基因進行篩選，發現Itgb1可能是miR-134-5p的潛在靶基因。過表達miR-134-5p會引起Itgb1的mRNA和蛋白表達量減少，從而發揮抑制破骨細胞形成的功能。既往研究表明，整合素受體不僅是細胞黏附和遷移的效應器，在細胞分化過程中也發揮著重要作用。Itgb1可調節神經元和星形膠質細胞的分化、角質形成細胞分化、Ⅱ型肺上皮細胞分化以及軟骨發生等，同時Itgb1在多種細胞表面表達，其中包括破骨細胞[18-19]。Wang等[20]在研究中發現Itgb1作為IGFBP1的關鍵受體，對于其發揮促進破骨細胞生成的功能至關重要。而miR-134-5p和Itgb1的靶向關系及二者在破骨細胞中發揮的作用尚未見報道。

綜上所述，miR-134-5p可能通過抑制Itgb1基因表達來抑制破骨細胞形成，從而參與骨改建的過程。但若要明確miR-134-5p對Itgb1基因的具體調控作用，仍需進一步的luciferase實驗進行驗證，并有必要完善miR-134-5p對破骨細胞分化、凋亡的影響。