結核分枝桿菌利福平耐藥分子藥敏結果與其表型藥敏差異的研究

羅嘉韻，余明均，廖衛平

1.佛山市第四人民醫院呼吸與危重癥醫學科，廣東 佛山 528000；2.佛山市第四人民醫院.檢驗科，廣東 佛山 528000

結核病是全球公共衛生組織重點關注的慢性傳染性疾病，主要是由結核分枝桿菌感染所引起。全球感染結核分枝桿菌人數已達到十幾億，每年新發病例達千萬，死亡病例達到百萬，尤其是耐藥菌株的流行，造成疫情日益嚴重[1-2]。據不完全統計，我國耐多藥/耐利福平初治耐藥率約為6.6%，復治耐藥率為30%[3]。利福平是一種廣譜抗生素，由利福霉素類半合成，屬一線抗結核藥物。但利福平耐藥是影響抗結核效果的主要因素，通常有80%以上對利福平耐藥性菌株也對異煙肼產生一定的耐藥性，并逐漸成為結核病耐藥性的標志物[4-5]。因此掌握利福平耐藥機制，有助于結核病的早期診斷、準確控制。既往臨床藥敏試驗測定常用羅氏試驗，但耗費時間長，菌株分離培養需要3～8周，隨后再耗費4 周時間才能得到藥敏結果，難以在短時間內取得理想、可靠、準確的藥敏結果。隨著檢測技術的快速發展，分子檢測技術逐漸被用于菌株檢測，并取得顯著效果。但在臨床實際工作中，分子技術與傳統藥敏試驗存在診斷結果差異性，給臨床治療帶來困難。本研究就結核分枝桿菌利福平耐藥的分子藥敏與其表型藥敏檢測的差異性進行分析，以期為臨床治療提供一定的參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2018年1月至2020年12月在佛山市第四人民醫院進行Xpert MTB/RIF 檢測的4620例患者中篩選出480株結核分枝桿菌。標本每人1 份，H37Rv 標準菌株來自中國藥品生物制品鑒定所。培養菌株標本收集患者痰液、肺泡灌洗液進行分離獲得，按照實驗規程操作。納入標準：①患者年齡≥18 歲；②符合結核診斷標準[6]；③同意納入本研究。排除標準：①患者年齡＜18歲；②合并肝腎功能衰竭、血液系統疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤患者。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 儀器與試制 實時熒光PCR 檢測儀(Xpert MTB/RIF，美國Cepheid)，液體培養儀器與配套試劑(Bactec MGIT960，美國BD)，利福平耐藥試劑盒及干粉(美國Sigma公司)。

1.3 檢測方法 所獲得的菌株置入100 L菌液內，分別接種在羅氏培養基，連續培養4周。4周后，用接種環刮取培養基上的一層菌落，加入已添加生理鹽水的離心管內，85℃下滅活20 min。滅活后的菌液離心5 min后丟棄上清液，用生理鹽水清洗，再100℃下金屬浴10 min，超聲15 min，離心后，留取上清液，設置DNA模板。設計rpoB基因引物序列，測定其基因型。利用Xpert MTB/RIF、Bactec MGIT960測定對利福平的耐藥性，獲取耐藥表型數據。Xpert MTB/RIF：留取標本置入前處理管內，添加標本體積的SR處理液2 mL，渦旋振蕩，30 s，靜置60 min，取處理藥品2 mL，緩慢添加至反應盒內，放置檢測模塊，再自動化檢測，讀取檢測結果。Bactec MGIT960：取0.5 mL處理后標本，添加培養管，培養陽性標本行藥敏試驗。藥敏試驗是根據分離出的結核分枝桿菌，觀察其生長情況，并與未藥物的對照管做對比，若菌株在對照、藥物培養管內均存在生長，則有耐藥，若僅在對照管內生長，則有敏感性。采用仞天青顯色法檢測最低抑菌濃度(MIC)。

1.4 觀察指標 (1)以羅氏培養法作為金標準，比較 Xpert MTB/RIF、Bactec MGIT960 的檢測效能；(2)觀察基因型與表型特征耐利福平不一致的檢測結果；(3)比較表型、基因型利福平耐藥率；(4)分析不同基因突變型菌株的MIC表達。

1.5 統計學方法 應用SPSS20.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差()表示，組間比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，一致性采用Kappa一致性檢驗。均以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 檢測效能 480 株分離的結核分枝桿菌利福平耐藥菌株52 株(10.83%)/敏感菌株428 株(89.17%)，Xpert MTB/RIF 檢出耐藥菌株 92.31%(48/52)，敏感度為95.83%，特異度為98.61%；Bactec MGIT960 檢出耐藥菌株96.15%(50/52)，敏感度為98.00%，特異度為99.30%，兩者檢出的靈敏度、特異度比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1和表2。

表1 Xpert MTB/RIF檢出效能比較(例)

表2 Bactec MGIT960檢出效能比較(例)

2.2 檢測藥敏不一致結果 52 株耐利福平菌株，RRDR區rpoB 基因突變46 株，6 株無氨基酸突變，Xpert MTB/RIF檢測耐藥而Bactec MGIT960檢測敏感有35 株，2 株無氨基酸突變；Xpert MTB/RIF檢測利福平敏感而Bactec MGIT960 檢測耐藥的變異菌株8 株，4株無氨基酸突變，一致性檢驗Kappa值為0.795，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 突變位點 RRDR 區 rpoB 基因突變 46 株(88.46%)，缺失突變位點分別有 508、509、526、511、533、531、516，其中 508、509 位點突變缺失部分屬GCA-CA，除去缺失突變，其他突變改變情況，見表3。

表3 46株RRDR區rpoB基因突變分析

2.4 不同突變型利福平MIC 水平測定 敏感：His526Asn、His526Gly、Asp516Tyr 突變類型菌株的MIC 水平均低于0.25μg/mL；高水平耐藥：His526Leu突變MIC水平為32μg/mL，低水平耐藥MIC值為0.5～4.0μg/mL；His526Arg突變菌株：低水平耐藥MIC值為1 μg/mL。Leu511Pro 突變：低水平耐藥：MIC 水平為1～2 μg/mL；Leu 533Pro 突變：敏感：MIC 水平 0.25～0.5 μg/mL；508、509 位缺失突變：低水平耐藥：MIC 水平2～4μg/mL，見表4。

表4 不同突變類型菌株MIC水平測定

3 討論

近年來，結核病耐藥性逐漸增加，主要是因化療方案應用不合理、依從性差等原因導致。尤其是耐多藥結核病病例的廣泛增多，使結核病的疫情傳播、診治方案更加嚴峻，大大地增加了結核病防治難度。通常耐藥結核病是對利福平或異煙肼等藥物耐藥，而耐多藥在體外證實對利福平、異煙肼等藥物存在耐藥性[7]。其中利福平是治療結核病的一線藥物，由鏈霉素產生的廣譜抗生素，是耐藥結核病的主要標志性藥物。掌握患者耐利福平機制，有助于早期診斷及控制結核病的發生、進展，并未臨床治療方案的選擇提供參考。結核分枝桿菌主要的耐藥機制較多，譬如靶基因結構改變、細胞壁的通透性異常改變、失活酶、代謝過程改變等，其中利福平耐藥產生的主要機制是藥物作用靶基因異常突變所致[8]。通常結核分枝桿菌的RNA聚合酶參與到細胞轉錄、RNA 延伸途徑，是菌株存活、生長的必需產物[9]。利福平的藥理作用機制是經過非共價鍵，特異性結合作用于RNA 聚合酶亞基介質，該介質是菌株DNA 生成的重要因子，通過下調RNA 聚合酶活性，阻斷細胞轉錄、RNA 延伸途徑，抑制細菌蛋白質的合成過程，發揮顯著的抗菌效果[10]。由于RNA聚合酶由5個亞基單位組成，其基因編碼有rpoA、rpoB、rpoC、rpoZ，在基因編碼異常、基因突變造成RNA聚合酶亞基結構異常改變，以此產生利福平耐藥性[11]。因此在檢測利福平耐藥時，可根據基因分子靶標作為利福平耐藥測定的主要方法。

Xpert MTB/RIF 是檢測利福平耐藥的主要方法，操作簡便、快速準確，受到臨床重點關注。隨著耐藥分子機制的深入，利福平耐藥分子技術得到極大進展，其中Bactec MGIT960進行分子表型測定，也在極大程度上提高利福平耐藥性診治水平[12]。本研究中Xpert MTB/RIF檢出耐藥菌株92.31%，Bactec MGIT960則為96.15%，兩者靈敏度、特異度比較差異均無統計學意義；Xpert MTB/RIF、Bactec MGIT960檢測一致性檢驗的Kappa 值為0.795。據劉立賓等[13]報道，將Bactec MGIT960 的藥敏檢測結果作為金標準，Xpert MTB/RIF 檢出敏感率為96.21%，且藥敏結果的一致性為0.794。因此兩種方法對檢測利福平耐藥有積極意義。兩者間的檢測結果存在不一致性可能是因其他原因造成利福平耐藥，不單單是因基因突變導致藥物耐藥產生。此外，BACTEC MGIT960同Xpert MTB/RIF相比較，其仍然存在耗時較長的不足，難以充分滿足臨床診斷的需要。有研究指出，結核分枝桿菌耐藥產生主要是因rpoB 基因突變導致，基因突變造成編碼RNA 聚合酶異常突變，引起氨基酸置換、空間構象改變，以此產生利福平耐藥[14]。本研究中52 株耐利福平菌株，RRDR區rpoB基因突變46株，6株無氨基酸突變，rpoB基因突變、缺失突變位點分別有508、509、526、511、533、531、516。通常531、526、516是常見的基因突變位點，以堿基置換為主要突變類型，而插入、缺失較少。在菌株耐藥性測定時，rpoB 基因不同位點突變所產生的利福平耐藥值也不同，本研究對不同突變型利福平MIC 水平進行了測定，其中His526Asn、His526Gly、Asp516Tyr突變類型菌株的MIC水平均低于0.25 μg/mL，為藥物敏感。其中rpoB 基因508、509位缺失是造成利福平低耐藥的主要原因，而基因His526Asn、His526Gly、Asp516Tyr 突變是唯一致利福平敏感的主要基因編碼，但也會產生利福平高耐藥。可能是患者感染混合菌株，造成不同基因突變使利福平耐藥也存在差異[15]。因此，由于XpertMTB/RIF 所采用精密設計的分子探針可以高效檢測到rpoB 核心區基因突變情況，對鑒定RFP 耐藥菌株具有較大幫助。

綜上所述，不同分子檢測方法對利福平耐藥測定有一定意義，但分子藥敏與表型藥敏檢測也有一定的差異性，臨床上可根據具體情況將兩者作為利福平耐藥檢測的有效選擇，以指導抗結核藥物的選擇。在結核分枝桿菌經利福平耐藥性測定，利福平耐藥性較高，rpoB基因突變是其主要改變原因，不同基因突變類型，使利福平耐藥水平也存在差異，但其結果依然無法肯定藥敏方法的可靠性，需臨床進一步研究探討。