藏豬和大約克豬FBXO32基因多態性及表達差異分析

王宇 徐士軍 孫雪倩 葉幼榮 張健 商鵬

摘要：為明確FBXO32基因在高原藏豬與大約克豬肌肉中的表達差異性，選取這2個豬種作為試驗動物，采用雙脫氧測序技術對藏豬（33頭）、大約克豬（32頭）FBXO32基因的5′UTR啟動子區進行單核苷酸多態性（SNPs）篩選，利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）技術檢測FBXO32基因在藏豬、大約克豬腿肌及背最長肌組織中mRNA的相對表達量。研究結果表明，在FBXO32基因的5′UTR啟動子區篩選到了G-257A和A-556G這2個SNPs位點，且SNPs位點在2個豬種群體間的基因型頻率有著顯著性差異（P<0.05）;通過轉錄因子預測，發現這2個SNPs位點與肌細胞的更新、分化和增殖相關，推測FBXO32基因的SNPs位點是調控肌肉生長的關鍵位點;藏豬腿肌、背最長肌組織中FBXO32基因的mRNA相對表達量都顯著高于大約克豬（P<0.05），由此推測FBXO32基因可以負向調控肌肉生長，這可能是導致高原藏豬生長速度慢的主要原因之一。本研究結果為進一步探究FBXO32基因在豬肌肉生長相關的調控機制提供了必要的理論依據。

關鍵詞：藏豬;FBXO32基因;肌肉生長;多態性位點;相對表達量

中圖分類號：S828.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）05-0146-05

收稿日期：2021-10-08

基金項目：西藏自治區重大科技專項（編號：XZ202101ZD0005N）;四川省區域創新合作項目（編號：2020YFQ0029）;西藏自治區林芝市巴宜區科技重點研發計劃（編號：2021-GX-SY-01）。

作者簡介：王 宇（1995—），男，江蘇宿遷人，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。E-mail：wangyu2512@163.com。

通信作者：商 鵬，博士，副教授，主要從事高原動物遺傳資源保護與功能基因組研究。E-mail：nemoshpmh@126.com。

骨骼肌是動物軀體重要的組成部分，占動物體質量約40%，對調節動物運動、新陳代謝等活動具有重要作用[1]。在家畜生產過程中，骨骼肌的生長發育可以影響家畜肌肉的產量，動物機體肌肉的生長速度及產量是評價動物生產性能的主要指標[2]。

FBXO32又稱肌肉萎縮盒F蛋白32（muscle atrophy F-box32，簡稱FBXO32），是一種E3泛素連接酶，在泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin-proteasome parthway，簡稱UPP）中具有非常重要的作用[3]，而UPP是真核生物細胞內一種高效的蛋白質降解途徑，該途徑也是降解肌蛋白的主要途徑之一[4]，目前，已被證明該途徑能夠加速肌蛋白的降解從而引起動物機體肌肉量降低或肌肉萎縮情況的發生[5]。動物肌肉的生長發育實際是肌蛋白等分解與合成平衡累積的結果[6]。作為一種E3泛素連接酶，FBXO32可以靶向幾種蛋白進行調控，在動物骨骼肌相關研究中，有關肌蛋白轉錄翻譯形成的過程中，起到主要作用的有起始因子eIF3-f和肌源性調節因子MyoD[7-8]，eIF3-f和MyoD對肌細胞分化和蛋白質合成與代謝以及與其他與肌肉生長相關特異基因的轉錄調控過程中起著關鍵的作用[9]。同時有研究表明FBXO32基因參與肌細胞的凋亡，除了靶向介導肌肉發育過程中的功能蛋白外，還靶向磷酸酶-1（MKP-1）進行蛋白酶降解過程[10]。Cheveland等在對虹鱒魚的禁食試驗中發現，禁喂飼料會導致虹鱒魚白色、紅色肌肉量減少，并在此過程中對FBXO32基因進行了定量檢測，得出了FBXO32基因的表達量增加會導致機體內肌肉量隨之減少的結論[11]。

藏豬是我國特有的高原、高寒放牧豬種[12]，具有很強的高原適應性，并且耐粗飼、肉嫩味美[13]。筆者所在研究團隊前期通過不同品種豬背最長肌組織轉錄組學分析，篩選出FBXO32為豬生長發育關鍵差異表達基因，為進一步驗證轉錄組數據的有效性，并探討FBXO32基因在豬骨骼肌組織中的相對表達量，本研究擬運用同樣在高原環境下飼養的藏豬、大約克豬的腿肌和背最長肌組織作為研究對象，利用第一代測序技術對FBXO32基因起始密碼子上游3 kb區域進行了多態性分析，并利用 RT-qPCR 技術分析FBXO32基因在藏豬和大約克豬腿肌及背最長肌組織中的表達差異情況，為進一步開展藏豬生長發育性能研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年10—12月在西藏農牧學院動物遺傳育種與繁殖實驗室內進行。采集180日齡西藏林芝本地的藏豬（n=33）、大約克豬（n=32）耳組織進行DNA提取。挑選以不限飼方式飼養至180日齡、生長情況相近的藏豬和大約克豬各10頭進行屠宰，取其腿肌和背最長肌組織，加入RNA保存液，迅速放入液氮，轉置于-80 ℃存放，用于RNA提取。

1.2 cDNA的合成及DNA、RNA的提取

本試驗采用苯酚-氯仿抽提法提取DNA。采用Trizol法提取組織總RNA;cDNA制備根據快速反轉錄試劑盒（KR180123）說明書進行，-20 ℃保存備用。用NanoDrop 2000檢測DNA、RNA的純度和濃度;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA、RNA的完整性。

1.3 DNA引物設計與合成

登錄GenBank下載豬FBXO32基因（登錄號：NC_010446.5）啟動子區域的DNA序列，利用Primer 5.0設計引物（引物信息見表1），由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 熒光定量PCR引物設計與合成

在NCBI（htttp：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載FBXO32基因（登錄號NM_001044588）mRNA序列，選用β-actin作為內參基因，利用軟件Primer 50設計引物（引物信息見表2），由生工生物工程（上海）有限公司進行合成。

1.5 基因型頻率、基因頻率與轉錄因子預測

首先對FBXO32基因起始密碼子上游3 kb區域的DNA序列進行PCR擴增，藏豬和大約克豬各10頭，每個個體抽取5 μL產物混合，混池測序分析基因的單核苷酸多態性。篩選出SNPs位點后，再根據篩選出的突變位點擴大個體進行測序。由測序結果統計各個SNPs位點的基因型頻率和等位基因頻率。用JASPAR在線網站（htttp：//jaspar.binf.ku.dk/）進行SNPs位點突變前后的轉錄因子預測。

1.6 實時熒光定量PCR

選取檢驗合格的cDNA為模板，每個個體設置3個重復。采用20 μL的反應體系對FBXO32和β-actin進行RT-qPCR檢測。用Livak法計算FBXO32基因在組織中的表達量。

1.7 統計分析

使用IBM SPSS Statisties 26.0軟件測定FBXO32基因表達量的差異顯著性，測定結果以P值表示。對FBXO32基因的基因型頻率和基因頻率進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 電泳檢測

提取的腿肌與背最長肌組織總RNA電泳結果見圖1。RNA樣本均能跑出28S、18S以及5S條帶，證明能滿足進一步試驗需求。

2.2 SNPs篩選

利用Chormas分析在起始密碼子上游3 kb區域的SNPs位點，通過測序比對， 發現FBXO32基因共有2個突變位點，分別為在-257 bp處有G/A突變，基因型為GG、GA和AA，記為G-257A;在 -556 bp 處有A/G突變，基因型為AG、AA和GG，記為A-556G（圖2）。

2.3 基因頻率和基因型頻率

從表3可以看出，FBXO32基因的突變位點在2個豬種內都與哈迪-溫伯格平衡定律相符合（P>0.05）。在藏豬與大約克豬品種間，FBXO32基因2個突變位點的基因型頻率有著顯著性的差異（P<0.05）。

2.4 轉錄因子預測

對5′UTR啟動子區域的2個SNPs位點的轉錄因子通過在線網站進行預測，其中G-257A突變導致FOXP3轉錄因子消失并出現了新的轉錄因子OTX2;A-556G突變導致HAND2轉錄因子消失并出現了新的轉錄因子Etv4。

2.5 FBXO32基因在豬腿肌和背最長肌中的mRNA表達

利用RT-qPCR技術對FBXO32基因在藏豬、大約克豬腿肌和背最長肌組織中的表達水平進行檢測（圖3）。從圖3可以看出，在腿肌和背最長肌組織中藏豬FBXO32基因的mRNA相對表達量與大約克豬都存在著顯著差異（P<0.05）。

3 討論與結論

肌肉萎縮盒F蛋白32參與泛素化降解蛋白質的過程，主要在哺乳動物的肌肉和心臟組織中表達[14]，是促進肌蛋白降解的特異蛋白，進而影響動物機體的肌肉生長[6，15]。

本研究在FBXO32基因的5′側翼區域發現2個SNPs位點（A-556G和G-257A），通過轉錄因子預測分析了FBXO32基因的SNPs位點突變前后轉錄因子的功能特性：（1）在G-257A位點，當G突變為A后，轉錄因子FOXP3消失，研究表明FOXP3（叉頭框蛋白P3）的表達有助于緩解相關病毒造成的肌肉萎縮，一旦FOXP3基因表達量下降或調控作用消失，肌蛋白降解增加，肌管萎縮[16]。Gong等在對小鼠的研究中發現，FOXP3的表達可以通過與Smad2/3/4的相互作用間接抑制c-Myc的活性[17]。c-Myc基因可以負調控很多與肌肉分化正相關的miRNAs進而抑制肌肉分化[18];當G突變為A后，在該位點結合產生新的轉錄因子OTX2，又稱同源異形框基因2（orthodenticle homeobox，OTX2），屬OTX家族，是影響多巴胺能神經元產生并控制運動與飲食的一個關鍵基因[19]。Wang等通過研究證明通過降低轉錄因子OTX2的表達可以保持豬的多能干細胞（iPSCs）自我更新和進一步誘導分化成為肌肉細胞[20]。OTX2對肌肉的生長發育可能起到負調控的作用[21]。在本研究中，等位基因A在藏豬上為優勢等位基因，突變率較高，導致促進細胞生長的FOXP3消失和抑制肌細胞生長OTX2的生成，對肌肉生長起到負調控作用。（2）在A-556G位點當A突變為G后，轉錄因子HAND2消失，該基因能通過參與多種信號通路，在生長發育過程有著十分重要的作用[22-23]。羅文在試驗中發現，敲除轉錄因子HAND2后會下調ERK信號通路的活性[24]。而ERK信號通路會促進成肌細胞增殖[25];在A-556G位點當A突變為G，結合產生新的轉錄因子ETV4（ETS variant 4），ETV4能參與調控多種生理功能，通過黏著斑相關蛋白（focal adhesion associated protein，FAAP）啟動子結合元件來調節FAAP的表達[26]，而FAAP與生長發育相關聯，對肌肉的功能起到積極的調控作用[27]，同時ETV4還可能參與抑制胚胎干細胞（ES）的增殖[28]，而ES細胞可以被誘導分化為肌肉細胞促進肌肉的生長[29]，因此ETV4基因的表達可間接抑制肌細胞的生長，進而影響肌肉的發育。在本研究中，等位基因G在藏豬上為優勢等位基因，突變率較高，突變后能導致促進肌肉生長的FOXP3消失和抑制肌肉生長的OTX2生成，對肌肉生長起到負調控作用。

陳曉琳等通過觀察電針對大鼠腓腸肌中FBXO32基因表達的影響發現當FBXO32過度激活，會導致肌肉蛋白降解加速，最終引起肌肉質量減輕[30]。Gomes等對小鼠進行禁食處理，檢測到小鼠骨骼肌中FBXO32基因的mRNA表達量增長超過9倍，會導致小鼠的肌肉量減少[31]。本試驗對藏豬和大約克豬這2豬種的腿肌、背最長肌組織進行RT-qPCR檢測發現，在腿肌和背最長肌組織上藏豬FBXO32基因的mRNA相對表達量都顯著高于大約克豬（P<0.05），該基因在生長相對緩慢的藏豬中呈高表達趨勢，而藏豬是青藏高原特有的高原小型豬種，生長慢，大約克豬生長相對較快，2個豬種具有明顯不同的生長趨勢。在其他動物骨骼肌研究和本研究中關于FBXO32基因均能得到其在骨骼肌中的表達量與肌肉生長趨勢呈現相反的結果。因此，FBXO32基因可能與豬肌肉的生長發育相關，并且對豬肌肉生長呈負調控作用。

本研究對藏豬和大約克豬FBXO32基因5′側翼區的序列進行SNPs篩選，發現了FBXO32基因2個突變位點G-257A和A-556G，經轉錄因子預測，發現這2個位點突變前后均與肌肉發育相關，利用RT-qPCR對FBXO32基因在2豬種腿肌和背最長肌組織中的相對表達量進行檢測，結果發現，FBXO32基因在腿肌和背最長肌組織上藏豬的表達量都顯著高于大約克豬的表達量（P<0.05），推測這2個位點可能是參與肌肉生長發育的重要調控位點。通過RT-qPCR技術并聯合基因頻率分布情況及轉錄因子預測結果推測，FBXO32基因影響著豬肌肉的生長發育，并且對豬肌肉生長呈現負調控作用。因此，FBXO32基因可能是調控肌肉生長的關鍵功能候選基因，本研究結果可為后續研究FBXO32基因在豬生長發育中的分子作用機制與分子標記輔助育種提供新思路和理論依據。

參考文獻：

[1]王雷杰. 金華豬與長白豬生長和肌肉發育差異的機理研究[D]. 杭州：浙江大學，2009：33-35.

[2]趙拴平，賈玉堂，徐 磊，等. 肉牛骨骼肌生長發育分子遺傳調控研究進展[J]. 中國牛業科學，2016，42（6）：57-60.

[3]于 晶. 豬FBXO32與其轉錄因子家族的基因克隆、定位、SNP檢測及與生產性狀的關聯分析[D]. 武漢：華中農業大學，2006.

[4]Xie P，Guo S B，Fan Y N，et al. Atrogin-1/MAFbx enhances simulated ischemia/reperfusion-induced apoptosis in cardiomyocytes through degradation of MAPK phosphatase-1 and sustained JNK activation[J]. Journal of Biological Chemistry，2009，284（9）：5488-5496.

[5]周建嫦. 骨骼肌蛋白質分解機制的研究進展[J]. 國外醫學（臨床生物化學與檢驗學分冊），1998，19（5）：228-231.

[6]Yin H，Zhang S，Gilbert E R，et al. Expression profiles of muscle genes in postnatal skeletal muscle in lines of chickens divergently selected for high and low body weight[J]. Poultry Science，2014，93（1）：147-154.

[7]Lagirand-Cantaloube J，Offner N，Csibi A，et al. The initiation factor eIF3-f is a major target for Atrogin1/MAFbx function in skeletal muscle atrophy[J]. The EMBO Journal，2008，27（8）：1266-1276.

[8]Tintignac L A，Lagirand J，Batonnet S，et al. Degradation of MyoD mediated by the SCF （MAFbx） ubiquitin ligase[J]. Journal of Biological Chemistry，2005，280（4）：2847-2856.

[9]Csibi A，Leibovitch M P，Cornille K，et al. MAFbx/atrogin-1 controls the activity of the initiation factor eIF3-f in skeletal muscle atrophy by targeting multiple C-terminal lysines[J]. Journal of Biological Chemistry，2009，284（7）：4413-4421.

[10]Chen F M，Chang H W，Yang S F，et al. The mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 （MKP-1） gene is a potential methylation biomarker for malignancy of breast cancer[J]. Experimental & Molecular Medicine，2012，44（5）：356-362.

[11]Cleveland B M，Evenhuis J P.Molecular characterization of atrogin-1/F-box protein-32 （FBXO32） and F-box protein-25 （FBXO25） in rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）：Expression across tissues in response to feed deprivation[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Biochemistry and Molecular Biology，2010，157（3）：248-257.

[12]強巴央宗，張 浩，紀素玲，等. 藏豬屠宰性能和肉質測定與分析[J]. 中國畜牧雜志，2008，44（21）：10-11，48.

[13]商 鵬，強巴央宗，張 博，等. 藏豬選育群屠宰性能和肉質測定分析[J]. 黑龍江畜牧獸醫，2015（2）：30-32.

[14]王愛蘭. F-box基因在動物中的進化和群體遺傳學研究[D]. 楊凌：西北農林科技大學，2015：23-25.

[15]Choi J，Costa M L，Mermelstein C S，et al. MyoD converts primary dermal fibroblasts，chondroblasts，smooth muscle，and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1990，87（20）：7988-7992.

[16]Nagai Y，Lam L，Greene M I，et al. FOXP3 and its cofactors as targets of immunotherapies[J]. Engineering，2019，5（1）：115-121.

[17]Gong Z Q，Jia H，Yu J Q，et al. Nuclear FOXP3 inhibits tumor growth and induced apoptosis in hepatocellular carcinoma by targeting c-Myc[J]. Oncogenesis，2020，9：97.

[18]Bui T V，Mendell J T.Myc：maestro of microRNAs[J]. Genes & Cancer，2010，1（6）：568-575.

[19]周笑莉，劉憶思，陳東風，等. 龜板提取物調控Otx2基因促進神經干細胞向多巴胺神經元分化的研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2017，28（2）：171-176.

[20]Wang N，Wang S L，Wang Y X，et al. SALL4 maintains self-renewal of porcine pluripotent stem cells through downregulation of OTX2[J]. Frontiers of Agricultural Science and Engineering，2019，6（1）：81.

[21]郭 濤，劉 通，陳江煒，等. 生長分化因子-11促進小鼠誘導性多能干細胞向心肌細胞定向分化的研究[J]. 心臟雜志，2016，28（3）：279-284.

[22]Tsuchihashi T，Maeda J，Shin C H，et al. Hand2 function in second heart field progenitors is essential for cardiogenesis[J]. Developmental Biology，2011，351（1）：62-69.

[23]Holler K L，Hendershot T J，Troy S E，et al. Targeted deletion of Hand2 in cardiac neural crest-derived cells influences cardiac gene expression and outflow tract development[J]. Developmental Biology，2010，341（1）：291-304.

[24]羅 文. Hand2及Pten在第二心場增殖和發育中的功能研究[D]. 南京：南京大學，2015.

[25]徐海俠. 低頻脈沖電磁場通過MAPK/ERK信號傳導通路促進C2C12成肌細胞增殖[D]. 廣州：南方醫科大學，2018.

[26]劉紅艷. PEA3對FAAP基因的調控[D]. 濟南：山東師范大學，2015.

[27]張 旭，馬 紅，劉 娣，等. 小鼠黏著斑相關蛋白在不同組織中的表達分析[J]. 畜牧與獸醫，2013，45（6）：59-61.

[28]Akagi T，Kuure S，Uranishi K，et al. ETS-related transcription factors ETV4 and ETV5 are involved in proliferation and induction of differentiation-associated genes in embryonic stem （ES） cells[J]. Journal of Biological Chemistry，2015，290（37）：22460-22473.

[29]蔣芳萍，張曉剛，丘 彥，等. 成熟心肌細胞誘導胚胎干細胞定向分化為心肌樣細胞[J]. 中國病理生理雜志，2009，25（5）：1030-1033，1037.

[30]陳曉琳，吳宗輝，范 蕊，等. 電針對糖尿病大鼠腓腸肌中肌球蛋白重鏈降解的影響[J]. 針刺研究，2019，44（9）：653-658.

[31]Gomes M D，Lecker S H，Jagoe R T，et al. Atrogin-1，a muscle-specific F-box protein highly expressed during muscle atrophy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（25）：14440-14445.