農作物中Cry1A(c)和CP4-EPSPS轉基因成分雙重實時熒光PCR檢測方法的建立

羅建興 劉國強 其勒木格 郭梁

摘要：采用羧基熒光素（FAM）和六氯熒光素（HEX）熒光基團標記探針，建立針對農作物中常見抗蟲和抗除草劑基因的雙重實時熒光PCR檢測方法，通過特異性、檢出限以及模擬摻假試驗驗證此方法在轉基因檢測中的適用性。特異性檢測試驗中僅轉基因作物（轉基因棉花、轉基因水稻、轉基因大豆）和陽性質粒檢測出相應轉基因成分，其余樣品均未出現明顯PCR擴增曲線;檢出限結果表明，雙重實時熒光PCR方法對Cry1A（c）、CP4-EPSPS基因的檢出限分別為1、0.1 ng，所建立的標準曲線r2值均大于0.98，具有對農作物中的轉基因成分進行定量檢測的能力;模擬摻假檢測顯示此方法可檢測到1%的Cry1A（c）和5%的CP4-EPSPS轉基因成分。綜上所述，本試驗建立的雙重實時熒光PCR法適用于對Cry1A（c）和CP4-EPSPS轉基因成分的快速檢測和定量分析。

關鍵詞：轉基因;Cry1A（c）基因;CP4-EPSPS基因;雙重實時熒光PCR;特異性;檢出限;模擬摻假

中圖分類號：TS207.3 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）05-0023-05

收稿日期：2021-04-16

基金項目：錫林郭勒職業學院重點科研項目（編號：ZD-2020-04、ZD-2019-01）。

作者簡介：羅建興（1993—），男，陜西榆林人，主要從事食品安全檢測和風險評估及轉基因成分檢測研究。E-mail：ljxylyh@126.com。

通信作者：郭 梁，博士，主要從事轉基因成分檢測和動物源性成分檢測以及微生物資源開發研究。E-mail：herdman86@163.com。

轉基因是指利用現代生物技術，將一些有利于人類生產生活的外源基因導入動物、植物或微生物中，通過對生物體內DNA分子修飾改造達到改變原物種遺傳性狀的目的，從而使原物種獲得本不具備的優良品質和特性[1-2]。1996年轉基因煙草的商業化種植，標志著全球轉基因商業化時代正式到來[3]。由于轉基因具有提高產量、改善產品品質、抗蟲、抗氧化劑、抗逆、性狀優良等特性，全球都加大了對轉基因作物的種植[4-6]。有研究表明，截至2018年年底，全球轉基因作物種植面積已達到1917億hm2[7]。據有關機構預計，2020年轉基因食品帶來的生物經濟將直接達15萬億美元，從而成為保持經濟可持續發展的中堅力量[8]。

轉基因技術在農作物上的廣泛應用不僅帶動了全球經濟發展，同時也產生了巨大社會效益，但任何技術的發展和進步都離不開風險管理。目前，一些人認為轉基因農產品在營養成分、毒理性、潛在致敏性等多方面存在食品安全風險，會對環境及人類健康產生巨大影響[9-11]。20世紀90年代有研究表明，斑蝶幼蟲在食用轉基因馬利筋草后，產生了40%以上的死亡率[12]。同時代的英國研究者給大鼠投食轉基因馬鈴薯，最終導致大鼠免疫系統受損，身體發育出現異常[11]。此類事件的發生間接推動了轉基因檢測技術的發展，目前針對轉基因的檢測技術主要分為3個方面，即基于核酸、蛋白[13]及小分子代謝物[14]的檢測。由于核酸本身的穩定性相比蛋白和小分子代謝物較強，在各種產品加工過程中穩定、不易降解，同時制備過程簡單、成本低[15-16]。因此，目前的檢測技術尤以基于核酸檢測居多，核酸檢測應用較為廣泛的主要是PCR技術。傳統PCR只能對單一基因進行檢測，在一定程度上具有檢測通量低的缺陷，而多重PCR雖具有擴增多重靶標的特點，但在后續電泳檢測試驗中卻很難對一些大小相近的DNA片段進行區分[17]。而熒光定量PCR由于特異性強、靈敏度高、無交叉污染且高通量的特點成為目前轉基因檢測的有效主流技術[3]。

Cry1A（c）和CP4-EPSPS分別是轉基因植物中常見的抗蟲和抗除草劑基因[18]，在現代農業生產生活中對農作物的優良品質和高產等起著非常重要的作用。其中，Cry1A（c）是蘇云金芽孢桿菌的一種殺蟲晶體蛋白，自然界的一些敏感幼蟲在吞食附帶有該蛋白的農作物后會形成活性毒素，最終導致昆蟲因滲透壓失衡死亡，該轉基因技術目前已廣泛應用于現代農林衛生害蟲防治[19]。CP4-EPSPS是一種抗除草劑草甘膦基因，能夠消除田間雜草，降低人工成本[20]，目前沒有Cry1A（c）和CP4-EPSPS同步檢測的研究和應用。因此，本試驗通過建立雙重實時熒光PCR檢測方法對植物中Cry1A（c）和CP4-EPSPS轉基因成分進行檢測，以期為轉基因食品安全檢測提供高效的檢測手段和方法，從而保證食品的安全性和民眾知情權。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

3種轉基因試驗樣品（轉基因棉花、轉基因大豆、轉基因水稻）由從事轉基因基礎研究的實驗室提供;8種普通非轉基因作物（棉花、水稻、大豆、玉米、小麥、苜蓿、白菜及煙草）于錫林浩特市本地農貿市場及超市采購。

TransStart Probe qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司;qPCR引物和探針委托北京睿博興科生物技術有限公司進行合成;DNA提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。

高速臺式離心機（型號為5418R），德國艾本德股份公司（Eppendorf AG公司）;核酸蛋白測定儀（型號為Nanodrop 2000c），美國Thermo Fisher Scientific;實時熒光PCR儀（型號為7300Plus），美國ABI公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物和探針的設計與合成 參考GB/T 19495.4—2018[21]用熒光基團FAM和HEX分別標記Cry1A（c）和CP4-EPSPS探針并委托北京睿博興科公司合成引物和探針，2種基因引物與探針序列見表1。

1.2.2 試驗樣品基因組DNA的提取與純化 采用溴化十六烷三甲基銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取DNA，并加適量的滅菌雙蒸水溶解樣品DNA。經核酸蛋白分析儀測定濃度后，將試驗樣品DNA終濃度稀釋至約100 ng/μL，且使D260 nm/D280 nm為1.8～2.0，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 陽性質粒DNA的提取 本實驗室具有事先經過驗證且特異性及可靠性檢測結果均良好的陽性質粒pCry1A（c）和pCP4-EPSPS，能夠在試驗中起到陽性對照的作用，按DNA提取試劑盒所述步驟提取質粒DNA，經核酸蛋白分析儀測定濃度后，將其終濃度稀釋為0.5 ng/μL，于-80 ℃保存備用。

1.2.4 實時熒光PCR反應體系及條件 反應體系（總體系20 μL）：上下游引物各1 μL，探針1 μL，模板DNA1 μL，TransStart Probe qPCR SuperMix 10 μL，補水至20 μL。反應條件：94 ℃預變性30 s;94 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環，在每次循環退火時采集熒光信號。

1.2.5 特異性檢測試驗 以“1.1”節所示試驗樣品的DNA及“1.2.3”節提取的2種轉基因陽性質粒DNA為模板，按照上述PCR反應體系加樣，對設計和合成引物及探針進行特異性檢測試驗。根據典型擴增曲線和各反應體系循環閾值的差異驗證Cry1A（c）和CP4-EPSPS這2種基因引物和探針對于不同樣品DNA模板的特異性。

1.2.6 檢出限檢測試驗及定量分析 將質量濃度同為10 ng/μL的轉基因棉花和轉基因大豆等體積混合，加滅菌雙蒸水對混合DNA原液進行10倍梯度稀釋，使各梯度DNA模板質量濃度分別為10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/μL，然后按照反應體系加樣進行熒光定量PCR擴增反應，通過反應測定試驗的檢出限。根據檢出限分析結果制作標準曲線，對DNA樣品中的轉基因成分作定量分析。

1.2.7 模擬摻假檢測試驗 將同濃度轉基因作物DNA與其非轉基因作物DNA（轉基因棉花+普通非轉基因棉花、轉基因大豆+普通非轉基因大豆）按不同體積進行混合，使轉基因作物成分百分含量分別為0.1%、1%、5%、10%，然后按照實時熒光PCR反應體系及程序進行模擬摻假試驗檢測，以檢驗引物和探針在轉基因作物摻假檢測試驗中的適用性。

1.3 數據處理

通過試驗儀器自帶軟件處理和分析檢測結果，數據均以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 特異性檢測

利用雙重實時熒光PCR技術對Cry1A（c）和CP4-EPSPS基因引物和探針進行特異性檢測，檢測結果如表2和圖1所示。可以看出，轉基因棉花和轉基因水稻中均檢測出Cry1A（c）基因，轉基因大豆中檢測出CP4-EPSPS基因，在混合陽性質粒中2種基因均有檢出，以上試驗結果循環數（CT值）的標準差均在0.1～1之間，且擴增曲線具有很好的平行度（每個樣品3個平行反應），說明試驗檢測結果較好，而對于其他樣品的檢測無明顯特異性擴增曲線，進一步說明設計引物及探針對于不同檢測樣品的特異性。

2.2 檢出限檢測與定量分析

特異性檢測試驗表明，轉基因棉花和轉基因大豆中分別含有Cry1A（c）和CP4-EPSPS基因，將上述2種樣品DNA進行同濃度等體積混合，并進行梯度稀釋，得到質量濃度分別為10、1、0.1、0.01、0001、0.000 1、0.000 01 ng/μL的樣品，以不同濃度樣品DNA為模板（每個濃度樣品6個平行反應），通過雙重實時熒光PCR檢測以測定引物和探針的檢出限，相應的CT檢測結果如表3所示，擴增曲線見圖2，以擴增結果CT≤35次時判定為確認檢出。可以看出，Cry1A（c）、CP4-EPSPS基因在混合DNA中的檢出限分別為1、0.1 ng，試驗使用△CT法進行相對定量，檢出限試驗結果顯示DNA濃度的對數值與其對應的CT值呈線性關系，然后以模板DNA濃度的對數值為橫軸、CT值為縱軸得到回歸方程，結果見圖3。既得2種基因的標準曲線方程如下：Cry1A（c），y=-3.682x+53.86，r2=0983 6;CP4-EPSPS，y=-2.616x+47.69，r2=0.987 2。由于雙重擴增2個基因的r2顯示標準曲線呈明顯線性相關，說明該方法可適用于轉基因作物中Cry1A（c）和CP4-EPSPS這2種基因的雙重檢測。

2.3 模擬摻假檢測

試驗將同濃度轉基因作物DNA與非轉基因作物DNA按一定比例混合來模擬摻假檢測，摻假組合為轉基因棉花+非轉基因棉花（組合1）、轉基因大豆+非轉基因大豆（組合2），按比例混合使混DNA中轉基因成分含量為0.1%、1%、5%、10%，利用雙重實時熒光PCR技術進行檢測，檢測結果見表4。以擴增結果CT≤35次時判定為確認檢出，由此可知，組合1中針對Cry1A（c）基因的檢測在摻假試驗中能夠檢測到1%的轉基因棉花成分，針對CP4-EPSPS基因的檢測因組合1樣品中不含有該轉基因成分，因此未檢測到（圖4）。綜上所述，本試驗建立的雙重實時熒光PCR方法適用于對摻假樣品中的轉基因成分檢測。同理，組合2中針對CP4-EPSPS基因的檢測在試驗中能夠檢測到5%的轉基因大豆成分，相較組合1，其檢測結果較差。

3 結論與討論

本試驗在特異性檢測過程中以水作為空白對照，并且增加了提取空白的特異性檢測，進一步加強了試驗檢測的完整性，在對試驗材料的檢測中，僅在陽性質粒及轉基因作物檢出轉基因成分，其他普通非轉基因樣品中并未檢出轉基因外源基因，說明試驗引物和探針具有較好的特異性，能夠滿足對轉基因定性檢測。對樣品原液梯度稀釋進行檢出限檢測，結果表明，Cry1A（c）、CP4-EPSPS基因在混合DNA中的檢出限分別為1、0.1 ng，以CT值為縱軸、模板DNA濃度的對數值為橫軸制作標準曲線，線性回歸方程r2均大于0.98，說明檢測結果能夠較好地對外源轉基因進行定量分析。模擬摻假在一定程度能夠對檢測方法或技術的適用性進行評估和檢驗，本試驗顯示，雙重實時熒光PCR法對轉基因成分的檢測分別為1%[Cry1A（c）]和5%（CP4-EPSPS），一定程度上能滿足實際檢測需求。

2017年的國際農業生物技術應用服務組織（ISAAA）數據顯示，1996—2016年20年間轉基因共使農作物增產6.576億t[22]，全球轉基因種植面積的逐年增加使得轉基因產品在市場上的份額也越來越大，這都給轉基因檢測帶來了巨大的挑戰。同時，由于基因元件的復雜性和轉基因作物的多樣性加大了轉基因檢測的難度和需求。2009年，吳珊等對大豆產品外源基因做了普通PCR、熒光定量PCR及微流控芯片等3種方法的靈敏度檢測比較，結果顯示，普通PCR對于個別基因存在無法檢測到或凝膠條帶較弱的情況，根據普通PCR和凝膠檢測結果容易造成假陰性。熒光PCR和微流體芯片技術檢測則不存在此類問題，且檢測結果更好，靈敏度和檢測效率也更高[23]。王穎等也對普通PCR和熒光PCR檢測轉基因成分進行了比較[24]，得出了相同的結論。尹全等利用多重PCR對進口轉基因玉米進行篩查檢測，通過構建的基因元件信息矩陣表得出，必須檢測2個或2個以上基因才能夠對同一物種不同品系的轉基因作物達到檢測的目的[25]。相比常規PCR技術，多重PCR可以對多個靶基因片段進行檢測，不僅打破常規PCR因引物受限只能檢測1個目的片段的局限，還大幅提高了檢測的效率，能夠較好地滿足對多個轉基因品種的檢測需求。本試驗雙重實時熒光PCR技術對農作物中Cry1A（c）和CP4-EPSPS轉基因成分檢測方法，相比于多重PCR不僅檢測準確性、靈敏度更高且能夠根據標準曲線進行相對定量。

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