氣相色譜-串聯質譜法測定茶葉中嘧菌酯殘留量的不確定度評定

陳秀寬 顧靜 梁少東 張銓

摘 要：目的：評定氣相色譜-串聯質譜法測定茶葉中嘧菌酯殘留量的不確定度。方法：建立不確定度評定的數學模型，對測量結果的每個不確定度來源進行分析和評定。結果：茶葉中嘧菌酯殘留量為0.100 mg/kg，其擴展不確定度為0.005 mg/kg（P=95%，k=2）。結論：加標回收率和標準工作溶液配制引入的不確定度分量是影響嘧菌酯殘留量不確定度的主要來源。

關鍵詞：氣相色譜-串聯質譜;嘧菌酯;不確定度;茶葉

Uncertainty Evaluation for the Determination of Azoxystrobin Residues in Tea by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CHEN Xiukuan， GU Jing， LIANG Shaodong*， ZHANG Quan

（Beihai Food and Drug Inspection Institute， Beihai 536000， China）

Abstract： Objective： To evaluate the uncertainty for the determination of azoxystrobin residues in tea by gas chromatography-tandem mass spectrometry（GC-MS/MS）. Methods： A mathematical model was established，and each component of uncertainty was calculated and evaluated. Results： When the azoxystrobin residues content in tea was 0.100 mg/kg， the expanded uncertainty was 0.005 mg/kg（P=95%，k=2）. Conclusion： The recovery of standard addition and the uncertainty components introduced by the preparation of standard working solutions are the main sources of uncertainty of residual azoxystrobin.

Keywords： Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry ; azoxystrobin; uncertainty; tea

嘧菌酯屬于甲氧基丙烯酸類殺菌劑，因其具有高效、低毒的特點，其使用量在全球逐漸增長[1-2]，且在我國茶葉種植中也有使用。日本肯定列表制度中嘧菌酯在茶葉中的最大允許殘留量為10 mg/kg，歐盟在茶葉中嘧菌酯的最大允許殘留量則更為嚴格，為0.1 mg/kg。而我國現行國標中，對茶葉中嘧菌酯的最大允許殘留量卻沒有規定[3]。目前我國氣質聯用法檢測茶葉的現行國標中[4-5]，其檢測的農藥并不包括嘧菌酯。因此，參照國標《食品國家安全標準 植物源性食品中208種農藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質譜聯用法》（GB 23200.113—2018）、《測定不確定度的評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[6]和《化學分析中不確定度的評估指南》CNAS—CL006：2019[7]，建立了一種利用QuEChERS凈化技術，快速測定茶葉中嘧菌酯的方法，并對其進行不確定度評定，為評價測量結果的可靠性提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用茶葉均于本地超市隨機購買。

1.2 試劑

乙腈，購自美國Fiher公司;乙酸，購自上海安譜公司;嘧菌酯（100 mg/L，1.2 mL）標準物質，購自壇墨質檢科技股份有限公司;水為娃哈哈純凈水。

1.3 儀器

TQ-8040NX氣相色譜-串聯質譜儀，日本島津公司;XSE205電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司;Thermo scientific ST40R高速冷凍離心機。

1.4 試驗方法

1.4.1 標準溶液的配制

取嘧菌酯標準物質（100 mg/L，1.2 mL）1.0 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成濃度為10 mg/L的標準中間液。取適量嘧菌酯標準中間液，用空白基質溶液稀釋，配制成0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L和0.20 mg/L系列標準工作液。基質混合標準溶液應現用現配。

1.4.2 樣品處理

稱取2.00 g試樣于50 mL塑料離心管中，加10 mL水渦旋混勻，靜置10 min。加入10 mL乙腈-乙酸（99∶1），6 g無水硫酸鎂、1.5 g醋酸鈉及1顆陶瓷均質子，劇烈振蕩1 min，4 200 r/min離心5 min。

吸取8 mL上清液加到含1.2 g硫酸鎂、400 mg PSA、400 mg C18及400 mg GCB的塑料離心管中，渦旋混勻1 min。4 200 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，上氣相色譜-串聯質譜儀測試。

1.4.3 儀器條件

（1）色譜條件。SH-Rxi-5Sil MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;進樣口溫度280 ℃;載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min;恒流模式;不分流進樣;進樣量1 μL;色譜柱溫度：初始溫度100 ℃，以30 ℃/min升至200 ℃，10 ℃/min升至300 ℃，保持10 min。

（2）質譜條件。將嘧菌酯進行全掃描，確定母離子，再給予一定的碰撞能量，掃描二級子離子，選取豐度較高的2個子離子分別為定量離子對和定性離子對，最后以MRM模式優化最佳碰撞能量。優化后的質譜參數及保留時間：嘧菌酯的定量離子對344.1→329.1，碰撞電壓16 V，定性離子對344.1→171.1，碰撞電壓40 V，保留時間15.625 min。

1.4.4 數學模型的建立

嘧菌酯含量計算公式為：

（1）

式中：X為試樣中被測物殘留量，mg/kg;C為基質標準工作溶液中被測物的濃度，mg/L;V為定容體積，mL;m為試樣質量，g。

2 結果與分析

2.1 不確定度的來源分析

根據數學模型，確定不確定度來源為樣品測定重復性引入的不確定度和樣品加標回收引入的不確定度（A類評定）;樣品稱量引入的不確定度、標準工作溶液濃度引入的不確定度（包括標準溶液純度、標準工作溶液配制過程、不同量程的移液器引入的不確定度、標準工作曲線擬合引入的不確定度）、前處理提取溶液體積引入的不確定度（B類評定）。由于溫度影響和溶劑膨脹系數的數值很小，其引入的不確定度對結果評定不影響，故不考慮溫度因素和溶劑膨脹系數因素引入的不確定度。

2.2 不確定度分量的評定與計算

2.2.1 A類不確定度的評定

（1）樣品測定重復性引入的不確定度Urel（R1）。在重復性測定條件下，對加標樣品（0.1 mg/kg）平行測定6次，嘧菌酯的加標回收結果為0.091 0 mg/kg、0.089 9 mg/kg、0.093 0 mg/kg、0.089 5 mg/kg、0.089 0 mg/kg和0.092 3 mg/kg，平均值為0.091 mg/kg，按照貝塞爾公式計算標準偏差為0.160 4%，其相對標準不確定度為：

Urel

（2）樣品加標回收引入的不確定度Urel（R2）。按照歐盟嘧菌酯最大允許殘留量，在6份茶葉樣品中添加0.1 mg/kg嘧菌酯，嘧菌酯的回收率分別為90.80%、89.40%、96.10%、89.50%、88.45%和91.75%，平均回收率為91.0%，測得嘧菌酯平均含量為0.091 mg/kg。

按照貝塞爾公式計算標準偏差為2.75%。標準不確定度為，相對標準不確定度為

用t分布來檢驗平均回收率是否與1.0有顯著性差異，經查表得知，在95%置信度，n=6，臨界值為2.57。如果平均回收率≥2.57，則說明有顯著差異。反之，則沒有顯著差異。檢測統計數據，得到。t值結果大于2.57，平均回收率與1.0有顯著差異，故需要按平均回收率修正結果，修正后嘧菌酯含量為0.100 mg/kg。

綜合所有A類各個分量分析評定，合成A類相對不確定度為：

2.2.2 B類不確定度評定

（1）樣品稱量引入的不確定度 Urel（m）

天平校準證書規定，精密為0.000 1 g天平最大允許誤差為±0.5 mg，按均勻分布估算，。由樣品稱量引入的相對不確定度為：

（2）標準工作溶液濃度引入的不確定度Urel（C）

（a）標準溶液純度引入的不確定度Urel（Ca）。根據使用的嘧菌酯標準溶液（100 μg/mL）證書得知，其擴展不確定度為3%，k=2。則。

（b）標準工作溶液配制過程引入的不確定度Urel（Cb）。標準中間液（10 μg/mL）由標準儲備液（100 μg/mL）稀釋10倍配制，即準確吸取1.0 mL儲備液于10 mL容量瓶，乙腈定容到刻度。依據JJG 196—2006[8]，1 mL單標線A級吸量管容量誤差為±0.007 mL，以均勻分布估算，其引入的相對不確定度為：

依據JJG 196—2006，10 mL A級容量瓶容量誤差為±0.020 mL，以均勻分布估算，其引入的不確定度為：

標準溶液配制過程引入的相對不確定度為：

（c）使用不同量程的移液器引入的不確定度Urel（Cc）。

使用上述標準中間液（10 μg/mL）配制嘧菌酯濃度為0.01 μg/mL、0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL和0.20 μg/mL的標準系列溶液。使用移液器為200 μL、100 μL、20 μL移液槍，容量瓶10 mL。根據移液槍檢定證書，不同檢定點的允許誤差，按照均勻分布估算，計算出移液器不同吸取體積的不確定度，見表2。

其中，10 mL容量瓶使用了5次，200 μL移液槍200 μL量程，100μL量程各使用了一次，100 μL移液槍100 μL量程使用了1次，20 μL移液槍20 μL量程，10 μL量程各使用了1次，2次。因此，使用不同量程的移液器引入的相對標準不確定度為：

（d）標準工作曲線擬合引入的不確定度Urel（Cd）。對5個濃度水平嘧菌酯標準工作液，用最小二乘法進行擬合。用擬合后的校準曲線，對加標樣品平行測定6次，結果見表3。因此由標準工作曲線擬合引入的相對不確定度見式（2）：

（2）

式中：Urel（Cd）為曲線擬合引入的相對不確定度;S（A）為擬合曲線的標準偏差;b為曲線斜率;p為樣品測定次數，p=6;n為標準溶液測定次數，n=5;

C為標準系列濃度，μg/mL;C0為待測樣品濃度平均值，0.018 2 mg/L;C為標準系列濃度平均值，0.076 mg/L。其中S（A）可按公式（3）計算：

（3）

式中：S（A）為擬合曲線的標準偏差;n為標準溶液測定次數，n=5;A為標準溶液儀器理論響應值;Ai為標準溶液儀器實際響應值。

由標準工作曲線擬合引入的不確定度由公式2計算，Urel（Cd）=0.003 4。

綜上所述，由標準工作溶液引入的相對不確定度為：

（3）前處理提取溶液體積引入的不確定度Urel（V）

提取液10 mL，用10 mL單標線吸量管（A級）移取，根據JJG 196—2006，10 mL單標線A級吸量管容量誤差為±0.02 mL，以均勻分布估算，其引入的相對不確定度為：

綜上所有B類各個分量的分析評定，合成B類相對不確定度為：

2.3 合成不確定度

將A類評定Urel（A）和B類評定Urel（B）進行合成，即得茶葉中嘧菌酯測定的相對合成不確定度為：

2.4 擴展不確定度的合成

假設測量結果符合正態分布，在置信區間為95%時，選擇包含因子k=2，則擴展不確定度為

2.5 測量結果不確定度的表示

根據JJF 1059.1—2012的規定，茶葉中嘧菌酯的含量結果為（0.100±0.005）mg/kg，k=2。

3 結論

通過評定可知，測量結果不確定度最大的來源為加標回收率和標準工作溶液配制引入的不確定度。因此，在試驗過程中，盡可能減少提取凈化步驟，提高樣品回收率，使用更高純度的標準物質和精密度更高的移液用具，可減少不確定度的引入，使結果更加準確、可靠。

參考文獻

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[2]柏亞羅.嘧菌酯、吡唑醚菌酯等六大產品以絕對優勢統領甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑市場[J].山東農藥信息，2018（5）：23-28.

[3]國家衛生健康委員會，農業農村部，國家市場監督管理總局.食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量：GB 2763—2019[S].北京：中國標準出版社，2019.

[4]國家衛生健康委員會，農業農村部，國家市場監督管理總局.食品安全國家標準 植物源性食品中208種農藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質譜聯用法：GB 23200.113—2018[S].北京：中國標準出版社，2018.

[5]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.茶葉中519種農藥及相關化學品殘留量的測定 氣相色譜-質譜法：GB/T 23204—2008[S].北京：中國標準出版社，2008.

[6]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.測量不確定度的評定與表示：JJF 1059.1—2012[S].北京：中國標準出版社，2012.

[7]中國合格評定國家認可委員會.化學分析中不確定度的評估指南： CNAS—? CL006：2019[EB/OL].（2019-04-09）[2022-01-03].https：//www.cnas.org.cn/rkgf/sysrk/rkzn/2019/04/896487.shtml.

[8]國家質量監督檢驗檢疫總局.常用玻璃量器檢定規程：JJG 196—2006[S].北京：中國計量出版社，2006.

通信作者：梁少東（1982—），男，廣西北海人，本科，工程師。研究方向：食品安全分析。E-mail：34697171@qq.com。