不同生物來源的法尼基焦磷酸合酶生物信息學分析

張家昌，史玲玉，郭兆鋮，趙元，徐鵬程，張俊麗

（山東第一醫科大學（山東省醫學科學院） 生命科學學院，山東泰安 271016）

萜類化合物（Terpenoids）是植物次生代謝產物中結構和數量最多的一類天然化合物，目前已知的種類超過50 000種[1]。由于其特殊且復雜多樣的生物活性，萜類化合物在醫藥、食品、化妝品等領域廣泛應用[2]。生物體中，萜類化合物是以異戊二烯為單位，經過環化、結構重排及碳骨架氧化等一系列反應衍生而來[3]。其中，法尼基焦磷酸作為重要的前體物質，是由法尼基焦磷酸合酶（Farnesyl Pyrophosphate Synthase，FPPS）催化異戊烯基焦磷酸及其異構體二甲基丙烯基焦磷酸生成[4]。

近年來，隨著合成生物學的發展，通過構建微生物細胞工廠合成萜類化合物成為研究的熱點[5-6]。在微生物合成次生代謝產物的研究中，關鍵酶編碼基因的分析、克隆、鑒定及功能分析一直是研究重點和難點[7-10]，FPPS作為合成途徑中的關鍵酶，其表達量與酶活力對下游萜類化合物合成有重要影響，在代謝工程和合成生物學等領域受到廣泛關注[11]。ANDERSON等[12]闡述了FPPS的特性、結構與功能關系、進化、定位及其作為藥物開發靶點的研究進展。劉美佳等[13]在克隆、分析珠子參FPPS基因cDNA序列的基礎上，通過調控皂苷生物合成關鍵酶的表達，成功實現了皂苷的生物合成。李永波等[14]在植物法尼基焦磷酸合酶基因克隆、表達、酶動力學研究等方面闡述了重要觀點。

本研究利用生物信息學方法，選擇不同生物（包括植物、動物、微生物）來源的FPPS，通過分析其理化性質、結構、功能及系統演化關系，比較和分析在進化過程中真核生物、原核生物以及不同物種間FPPS的進化差異，以期為采用分子生物學和合成生物學手段，構建生產萜類化合物的微生物細胞工廠奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取已在NCBI-Genbank數據庫中公布的20種生物的FPPS的核苷酸序列及氨基酸序列，序列號如表1所示。

表1 不同物種來源的法尼基焦磷酸合酶的核酸及蛋白質序列號

1.2 分析方法

1.2.1 FPPS氨基酸序列分析

通過 ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）獲得20個物種的FPPS氨基酸序列的理化性質。

1.2.2 FPPS系統進化分析

運用BioEdit將20個物種的核苷酸及氨基酸序列分別整合成一個Fasta格式的文件，然后利用Clustal Omega在線工具進行多序列比對，結果保存為“.clustal_num”格式的文件，可運用多序列比對結果編輯器如Jalview對其加工美化；系統進化樹的構建和檢驗通過本地軟件MEGA實施時，先將多序列比對結果保存成.meg格式，然后采用鄰接法構建進化樹，使用自展值（Bootstrap）重復檢驗1 000次。

2 結果與分析

2.1 FPPS氨基酸序列分析

通過在線工具ProtParam對FPPS的氨基酸序列進行研究，分析其氨基酸組成及理化性質，包括氨基酸數量、分子量、等電點、帶正負電殘基數、不穩定指數、脂肪族指數和蛋白質親疏水性（GRAVY）等信息，相關結果如表2所示。

表2 不同物種來源的法尼基焦磷酸合酶氨基酸序列的理化性質

從表2可以看出，氨基酸數量為288～419個不等，等電點在4～7波動，脂肪族指數為100左右；不穩定指數＞40的為不穩定類蛋白質，其中擬南芥、大腸桿菌、黑腹果蠅、牛、蜜蜂、黑猩猩、褐家鼠的FPPS屬于不穩定類蛋白質，其余屬于穩定類蛋白質；GRAVY為負值時，說明氨基酸為親水性的，為正值時說明氨基酸是疏水性的，其絕對值越大則其表示親/疏水性越強，即莢膜紅細菌來源的FPPS為疏水性蛋白質，其余來源的FPPS為親水性蛋白質。

2.2 FPPS系統進化分析

2.2.1 FPPS氨基酸序列比對分析

基因組不同功能區段在演化過程中面對不同的選擇壓力，重要的區段不易發生變化，不重要的區段易發生變化。多序列比對在系統發育分析、基因和蛋白質功能分析、突變分析、序列拼接方面都有重要的應用。

通過多序列比對發現，結構域I中除蜜蜂第二位氨基酸殘基為G外，G（1位）、K（2位）和R（5位）在另外19種生物中均為保守氨基酸，其賴氨酸殘基能夠促進FPPS與異戊烯焦磷酸（IPP）的結合。WANG等[15]發現與其他生物一樣，植物FPPS也具有5個保守結構域，即：結構域Ⅰ（GKXXR）、結構域Ⅱ（EXXXXXXLXXDDXXDXXXXRRG）、結構域Ⅲ（GQXXD）、結構域Ⅳ（KT）和結構域Ⅴ（GXXFQXXDDXXDXXXXXXXXGK XXXDXXXXK）。SZKOPINSKA等[16]發現，FPPS具有2個天冬氨酸富集區，即結構域Ⅱ和Ⅴ中的DDXXD（X代表任意氨基酸）。

2.2.2 FPPS氨基酸序列分子系統進化分析

系統發育分析用于描述同源序列之間的親緣關系的遠近，為了探索不同物種之間FPPS的親緣關系遠近，利用上述多序列比對結果構建進化樹，結果如圖1所示。

由圖1可知，FPPS蛋白的系統進化樹聚類分為植物、真菌、動物和細菌4個類群，具有較顯著的種族特異性。由上述多序列比對結果可知，蜜蜂FPPS氨基酸序列與其余真核生物FPPS相比，在保守區域某些位點容易發生變化，因此，蜜蜂與其余物種親緣關系較遠。而細菌等原核生物在保守位點發生一些位點的插入或缺失，因此，細菌單獨聚成一支。

3 結論

本研究以不同物種來源的FPPS核苷酸序列及氨基酸序列為研究對象，分析不同物種FPPS在進化中的差異，尋找它們易發生突變的位點以及保守序列。這為采用分子生物學技術，定點修飾編碼該酶保守區中某些重要氨基酸殘基密碼子提高酶催化速率，進而提高次生代謝產物的合成提供一定依據。